微生物学完整22ppt课件

.,1,第三节细菌形态与结构检查法,【教学内容】细菌的显微镜放大法和染色检查法法。【教学要求】掌握：细菌的染色检查法。了解：细菌的显微镜放大法。【教学重难点】重点：细菌的染色检查法。难点：细菌的染色检查法。【教学时数】：2学时【教学方法】：讲授法为主，演示法为辅。,.,2,显微镜放大法细菌形体微小，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜、电子显微镜）放大后才能观察。染色检查法细菌体小,半透明，经染色后才能观察较清楚。,.,3,普通光学显微镜的分辨率为0.25um。一般细菌都大于0.25um，故可用普通光学显微镜观察。,、普通光学显微镜(lightmicroscope),一、显微镜放大法,.,4,电子显微镜的分辨率为1nm。不仅能看清细菌的外形，内部超微结构可一览无余。,、电子显微镜(electronmicroscope),一、显微镜放大法,.,5,3、透射电镜,4、扫描电镜,.,6,二、染色检查法,由于细菌细胞微小又透明，一般先要经过染色才能作显微观察,革兰氏染色法,细菌染色,鉴别染色法,简单染色法,负染色：,正染色,死菌,活菌,抗酸性染色法,芽孢染色法,姬姆萨染色法,荚膜染色法,用美蓝或TTC等作活菌染色,.,7,（一）单染色法,1、原理细菌的体积小，五色半透明，在普通光学显微镜下不易观察清楚，通常需染色来增加菌体与背景之间的色差，这比不染色标本清楚易辨。由于细菌的等电点为pH25，在接近中性的环境中通常带负电荷，易与带正电荷的碱性染料相结合而染上颜色，故常用亚甲蓝、碱性复红、草酸铵结晶紫等染料染色。单染法只使用一种染料，所染的细菌均被染成一种颜色，一般能够显示细菌的形态、排列和大小，但不能显示细菌的内部构造。,.,8,、常用染料和器具大肠杆菌和金黄色葡萄球菌1824h培养物，生理盐水，亚甲蓝染色液，碱性复红染液，香柏油，二甲苯，显微镜，接种环，吸水纸，载玻片，酒精灯，擦镜纸。,.,9,、方法,（1）涂片取洁净的载玻片一块，滴一小滴生理盐水于载玻片中央(如被检材料是液体，可不加生理盐水)。将接种环在酒精灯火焰上灭菌，冷却后，伸人被检菌试管取菌少许(切不可多，更不可将培养基刮下)，混入载玻片上的生理盐水中，磨匀并涂抹成直径15cm左右的均匀薄层菌膜。将接种环灭菌后放回原处。（2）干燥涂片最好在室温中让其自然干燥。有时为了干燥得快些也可在酒精灯火焰上方烘干，但勿紧靠火焰；也可以用吹风机吹干。,.,10,、方法,（3）固定让菌膜面朝上，将载玻片在酒精灯火焰外层来回通过3次，此为“固定”。目的是使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使细菌粘附于玻片上，染色和水冲时不会脱落。（4）染色将细菌涂片平置，滴加1滴亚甲蓝(或复红染液)于菌膜上，染液以覆盖涂抹的标本为度，染色12min。（5）水洗斜置载玻片，用细水流从上端流下洗去多余的染液。（6）干燥自然干燥或用吹风机吹干水分。（7）镜检先用低倍镜找到物像，并将物像调到视野中央，再于标本上滴上一滴香柏油，置于油镜下进行观察。,.,11,、注意事项（1）固定时温度不可过高，以载玻片反面触及皮肤时热而不烫为宜。（2）水洗时，不要对着标本直接冲洗，以免冲去被检标本，一般以冲洗下来的水基本无色为度。（3）染色完毕，倾去水分，于室温中自然干燥，不可在标本上擦试，以免擦损标本。,.,12,.,13,（二）革兰染色法：C.Gram（革兰）于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。,二、染色检查法,.,14,（二）革兰染色法,、染色步骤（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S）（3）脱色（95%乙醇1020S）（4）复染（蕃红3060S）,.,15,A,B,B,B,A,B,A,A,（1）初染（结晶紫30S）,革兰氏染色程序和结果,（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S）（3）脱色（95%乙醇1020S）（4）复染（蕃红3060S）,.,16,A,B,B,B,A,B,A,A,革兰氏染色程序和结果,（2）媒染剂（碘液30S）,（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S）（3）脱色（95%乙醇1020S）（4）复染（蕃红3060S）,.,17,A,B,B,B,A,B,A,A,革兰氏染色程序和结果,（3）脱色（95%乙醇1020S）,（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S）（3）脱色（95%乙醇10-20S）（4）复染（蕃红3060S）,.,18,A,B,B,B,A,B,A,A,革兰氏染色程序和结果,（4）复染（蕃红3060S）,A：革兰氏阳性细菌G+,B：革兰氏阴性细菌G,为什么？,（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S）（3）脱色（95%乙醇1020S）（4）复染（蕃红3060S）,.,19,、染色原理,第一步：结晶紫使菌体着上紫色第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。G+菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。,.,20,、结果判断,菌体呈紫色的为革兰氏阳性菌（G+）菌体呈红色的为革兰氏阴性菌（G-）,.,21,阳性菌,阴性菌,革兰阳性革兰阴性,.,22,、注意事项,（1）载玻片要洁净无油。（2）涂片以匀薄为佳，切不可浓厚。过于密集的菌体，因洗脱不匀常呈假阳性。（3）要严格控制各试剂的作用时间，尤其是酒精脱色，时间过短，革兰阴性菌可染成紫色造成假阳性；反之，脱色时间过长，革兰阳性菌也可被染成红色造成假阴性。（4）碘液配制后，应装在密闭的暗色瓶内储存。如因储存不当，试液由原来的红棕色变成淡黄色，则不宜再用。,.,23,.,