Lecture4-e花环试验幻灯片.ppt

E花环试验ErythrocyteRosetteTest,豚鼠T细胞表面有E受体=CD2.家兔红细胞（RBC）表面有CD2的配体，即CD58.将淋巴细胞与RBC按一定比例混合后，在一定条件下就形成一个T细胞结合多个SRBC的玫瑰花一样的花环，即E-花环(erythrocyterosette)，取样涂片染色、镜检计数可得花环形成率。,E-花环实验原理,CD2andCD58smilarstructureligandofCD2-CD58ligandofCD58-CD2CD2alsocalledSRBC-R(绵羊红细胞受体),(一)1107/ml豚鼠淋巴细胞在血球计数板记数淋巴细胞数，并将其配成1107/ml浓度的淋巴细胞悬液。(二)1108/ml家兔红细胞用注射器吸取ml的阿氏液,心脏采家兔血2ml2000r/min离心10分钟以Hanks洗三次（2000r/min离心10分钟）。用Hanks液配制成1108/ml悬液。,实验材料,1.密度梯度离心法,粒细胞和红细胞(1.092g/l),分离液(1.0770.002g/l),淋巴细胞单核细胞1.070g/l,血浆层,豚鼠外周血,淋巴细胞分离液,离心,2.淋巴细胞分离液：聚蔗糖-泛影葡胺,豚鼠淋巴细胞的分离,操作流程,心脏抽取2ml血至含2ml阿氏液注射器中，加入2mlHanks液,取3ml稀释血，沿试管壁缓慢加入到2ml分离液中,2000rpm，离心20min,小心吸取淋巴细胞层，加入5倍体积的Hanks液,2000rpm，离心10min,弃上清，加入5倍体积的Hanks液,2000rpm，离心10min,弃上清，加入1mlHanks液细胞计数,取0.1ml107/ml淋巴细胞悬液置于试管中加入0.1ml108/mlRBC加入0.05ml灭活小牛血清置于37C水浴，25min低速离心，500rpm,5min加1滴0.8%戊二醛固定10min再加入1滴美兰染色1min取1滴高倍镜下计数花环形成率,E-花环实验操作骤,结果判断,高倍镜下计数200个以上的淋巴细胞。阳性细胞：受检淋巴细胞周围粘附有3个或更多红细胞的判为花环形成细胞(TRFC)。TRFC（%）=,TRFC100,未形成花环淋巴细胞数TRFC,正常参考值总E-花环形成率（Et）为60%-80%活性-E花环形成率(Ea)仅为Et的1/3-1/2，约20-40,1.SRBC与淋巴细胞混合后离心速度不能过高，在Et花环试验中，置4应至少1h以上或过夜。2.绵羊红细胞以保存1周内最好，超过2周则与淋巴细胞结合力下降，超过56周则不能再用。3.Et花环试验SRBC与淋巴细胞混合比例以10012001为宜，Ea花环试验中以101201为宜；淋巴细胞离体后不能超过6h，否则会影响花环形成率。4.温度对实验结果影响较大，故实验温度条件应保持一致，从4取出后应立即计数。5.计数前将沉淀细胞重悬时，使细胞团块松散均匀即可，不可强力吹打，以免SRBC从淋巴细胞上脱落。,总花环（Et）:如置4至少2h或过夜，所检出的E-花环称为总花环（Et），亦即T细胞的