真菌多糖的研究进展——真菌多糖的结构、提纯和应用

第24卷第4期2009年12月河北林果研究L砸B】EIJOIJRNAL0LFFDRL限YANDORARD瑚BV0L_24NO4DEC2009文章编号10049612OO904O44504真菌多糖的研究进展真菌多糖的结构、提纯和应用白岚浙江商业职业技术学院，浙江杭州310014摘要真菌多糖是从真菌的子实体、菌丝体和真菌发酵液中分离出来的一类具有广泛生物活性的大分子碳水化合物。现代医学与药理学研究表明，多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、延缓衰老、降血糖、降血压、降血脂等生理功效。综述了真菌多糖的化学组成，构效关系，提取与纯化，以及实际应用等现状与展望。关键词真菌多糖；化学结构；提取与纯化；生物活性；实际应用中图分类号Q9395文献标识码AADVANCEOFRESEARCHONSTRUCTUREOFFUNGALPOLYSACCHARIDESTRUCTUREPURIFICATIONANDAPPLICATIONOFFUNGALPOLYSACCHARIDELANZHEJIANGCOMMERCIALVOCATIONALCOLLEGE，HANGZHOU310014，CHINAABSTRACTFUNGALPOLYSACCHARIDEISMACMMOLECARCARBOHYDRATESWITHWIDESPREADBIOLOGICALACTIVITIES，ISOLATEDFROMFRUITBODIORMYCELIAORFERMENTEDLIQUORCONTEMPORALYMEDICALANDPHARMACOLOGICARESEARCHINDICATEDTHATTHEPOLYSACCHARIDESHAVEPROVIDEDPHYSIOLOGICALFUNCTIONWITHINCREASINGIMMUNITY，ANTITUMOR，DELNSSENESCENCE，REDUCINGBLOODSUGAR，PRESSURE，LIPINANDSOON31AISARTICLESUMMARIZEDPRESENTANDFUTURESITUATIONOFCHEMICALCOMPONMENT，RELATIONSHIPBETWEENSTRUCTUREANDFUNCTION，EXTRACTUL，ISOLATIONANDPURIFICATIONOFFUNPOLYSACCHARIDESANDITSPRACTICALAPPLICATIONKEYWORDSFUNGALPOLYSACCHARIDES；CHEMICALSTRUCTURE；EXTRACTIONANDPURIFICATION；BIOLOGICALACTIVITY；PRACTICALAPPLICATION真菌多糖FUNSALPOLYSACCHARIDES是从香菇、银耳、茯苓、猪苓、灵芝、云芝、黑木耳、猴头菇、冬虫夏草等食用真菌与药用真菌的子实体、菌丝体与菌丝发酵液中提取分离出来的，由醛糖或酮糖通过糖苷键连接起来的一类天然大分子碳水化合物。真菌多糖具有广泛的生物活性和药理作用，免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血糖、降血脂、抗衰老、抗溃疡、抗辐射、抗血栓、抗凝血、抗病毒、抑菌消炎等作用。而且，真菌多糖对正常细胞不产生毒副作用，因此成为当今医药与食品共同关注的课题。真菌多糖可应用于人类的防病、治病和保健，对其提取分离工艺的研究可促进食用真菌和药用真菌的深加工与进一步开发，也必将扩大真菌培养原料林业副产品的利用范围，有利于林业的持续发展和产品的综合利用。1真菌多糖的组成、结构与分类11真菌多糖的化学组成在已研究的真菌多糖中，其基本组成单位为糖或糖醛酸，包括木糖、岩藻糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖与葡萄糖醛酸。12真菌多糖的分子结构121一级结构PRIMARYSTRUCTURE包括糖基的组成、排列顺序、相邻糖基的连接方式及糖链有无分支、分支位置与支链长短等。真菌多糖的主链一级结构是均多糖，即由一种单糖为组成单位。目前发现的有两种一是葡聚糖GLUCAN，以31，3一糖苷键连接为主，兼有少量P一1，4一糖苷键或其他糖苷键。而侧链则是以P一1，6一糖苷键或P一1，3一糖苷键的低聚物。例如，香菇多糖和裂褶菌多糖的一级结构都属于这种连接方式。二是甘露聚糖H删1AN，其主链主要以收稿日期120090612；修改稿收期20090708基金项目浙江商业职业技术学院资助SZY200510。作者简介白岚1967一，女，吉林长春人，浙江商业职业技术学院，讲师，主要从事食品化学的教学研究工作。河北林果研究第24卷A一糖苷键方式连接。比如，冬虫夏草多糖为AL，2一糖苷键连接2，银耳多糖为AL，3一糖苷键连接。122高级结构亦称空间结构PAESTRUCTURE，是多糖发挥生理或药理作用的结构。包括二级结构、三级结构和四级结构。其中，二级结构是以氢键方式使多糖骨架键即主链形成各种聚合体的空间构型_4；三级结构是指多糖链单糖残基中的羟基、氨基、羧基，以及其他基团之间通过非共价键相互作用形成有序的空间构型；四级结构是指数个多糖链之问以非共价键结合而形成的聚合体。13多糖的分类目前，已从银耳_5与猴头菇各分离出5种多糖。现以银耳多糖为例说明。131酸性杂多糖姜瑞芝B等在研究从子实体分离的银耳孢糖化学结构时得到3种均多糖PSP2A，TSP2B，TSP2C，均为多分支，结构复杂的酸性杂多糖，其分子组成中的单糖为木糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸。132中性杂多糖这种多糖的相对分子质量均为8KD，其分子组成中的单糖主要是木糖、甘露糖、半乳糖与葡萄糖。其质量比为L2251754。由于分子中不含葡萄糖醛酸，故呈中性。133酸性低聚糖在分析银耳酸性杂多糖结构时，采用酸性水解方法从中分离出3种均质的酸性低聚糖H一1、H一2、H一3。其分子组成中的单糖均为D一吡喃葡萄糖和D一甘露糖；但是二者的分子数目之比不同H一1为13，H一2为12，H一3为11。由于分子中含有葡萄糖醛酸，故呈酸性。134胞壁多糖从银耳细胞壁中分离出两种胞壁多糖L5J一是胞壁内层的碱不溶性多糖，由D一木糖、D一甘露糖、D一葡萄糖和D一葡萄糖醛酸组成；二是细胞壁外层的酸溶性多糖，由D一木糖、D一甘露糖和D一葡萄糖醛酸组成。135胞外多糖这是由银耳细胞深层发酵孢子体中分离出来的酸性杂多糖。与子实体的酸性杂多糖相似，胞外多糖的主链结构为以A一1，3一糖苷键连接的甘露聚糖；二者不同之处是支链上略有差异，即胞外多糖主链的2，4，6位连接的依次是葡萄糖、葡萄糖醛酸和木糖组成的侧链【4。这表明，银耳的胞外多糖与子实体多糖在主要结构上无明显差异。2真菌多糖的构效关系21相对分子质量对多糖生物活性的影响研究表明，相对分子质量的大小是真菌多糖具备生理活性的必要条件，这可能与多糖分子形成高级结构有关。促使多糖充分发挥生物活性需要其分子质量应在一定范围，如果相对分子质量偏小，难以形成有序的高级结构如三股螺旋；如果相对分子质量过大，虽然能够形成高级结构，但由于分子体积过大，难以跨膜进入靶细胞而减低其生物活性。例如，冬虫夏草多糖相对分子质量为16KD的能够促进小鼠巨嗜细胞的吞噬活性，而相对分子质量为12KD的则无此活性2。对于裂褶菌多糖，相对分子质量大于100KD且具有三股螺旋结构的具有很强的抗癌活性，而低于50KD的多糖则无任何生物活性。22主链连接方式对多糖生物活性的影响实际应用表明，在主链以31，3一糖苷键连接为主的D一葡聚糖具有抗癌活性_6。香菇多糖、裂褶菌多糖、小核菌多糖均为这种连接方式的多糖，而且前两种多糖已被用作免疫药理制剂。同样，前面提到的3种银耳孢糖RISP2A，TSP2B，TSP2C的主链也是以B一1，3一糖苷键连接方式的D一甘露聚糖，也具有显著的免疫活性J。23分支度对多糖生物活性的影响分支度DEGREEOFBRANCH，DB是指主链每个单糖单位存在的分支数目，通常在002075。DB过小或过大的多糖，其生物活性均不如DB适中的多糖，即DB在02033的G一1，3一D一葡聚糖具有很高的生物活性7。比如，DB为02的猪苓多糖，DB为033的香菇多糖与裂褶菌多糖仅在C6上存在分支，均有很高的生物活性_2。24溶解性对多糖生物活性的影响目前认为，在植物提取分离的多糖中，水溶性多糖最为重要J。核磁共振分析表明7，以L31，3一糖苷键连接的D一葡聚糖，其主链上的多元羟基对提高抗癌活性具有重要作用。这是因为，多元羟基可提高多糖的水溶性。从黑木耳子实体中提取分离的一种葡聚糖B，水溶性较低，不表现出生物活性。但是，对其进行过碘酸氧化、硼氢还原以及温和水解，得到降解的水溶性多糖，具有较强的生物活性，显示出抑癌作用L9J。从茯苓菌核中提取的多糖，其主链是以B一1，6一糖苷键连接的葡聚糖，支链是以B一1，6一糖苷键连接的910个葡萄糖残基组成的低聚糖。该多糖易溶于稀碱而不溶于水，基本没有抗癌活性。但是，通过适当试剂处理，水溶性大大提高，其抗癌活性亦随之第4期白岚真菌多糖的研究进展447明显提高。3真菌多糖的提取与纯化31真菌多糖的提取按照溶解性，真菌多糖可以分为水可溶性多糖和水不溶性多糖；后者又可分为酸溶性多糖与碱溶性多糖_1。依据“相似相溶”原理，真菌多糖的提取可采用水提法如热水浸提法与微波辅助热水浸提法、酸提法、碱提法、盐提法、有机溶剂提法、酶提法如双酶提取法、超声液催化酶提取法等L1。311水提法大多数真菌多糖可溶于冷水，在热水中呈粘液，遇乙醇能沉淀，故传统的提取法多采用热水浸提法适用于水溶性多糖，然后用乙醇等低级醇沉淀。另外，还有稀酸水提法适用于酸溶性多糖与稀碱水提法适用于碱性多糖引。胡斌杰1等确定了传统热水法提取灵芝多糖的最佳工艺条件，料液比例120，材料粒度8O目，提取温度90，提取时间2H。但是，热水浸提法耗时较长，且收得率较低；而稀酸水提法和稀碱水提法易使多糖的空间结构破坏，活性丧失。312超声波提取法采用此法提取灵芝多糖和姬松茸多糖_1时，多糖收得率明显高于传统的热水浸提法。超声波法提取灵芝多糖的最佳工艺条件，料液比例115，材料粒度6O目，提取温度60，超声波时间25MINH。313酶解法相比之下，酶解法优于传统水提法。刘宁1等采用混合酶解法与水提法提取香菇多糖，前者的多糖收得率为L290，比后者高出626；而且时间上前者仅占后者的13，其产品在进行紫外吸收检测时杂质含量少，比后者更接近标准品。314影响多糖提取的因素影响真菌多糖提取效果的因素很多，诸如材料部位、材料粒度608O目、料液比例115120、溶剂种类热水、酸水、碱水、提取温度6080、提取时间0520H、提取次数3次、溶液PH，搅拌等均能影响多糖的收得率。为使多糖保持原来的分子结构与生物活性，应该尽量避免在酸性偏高的条件下操作。否则，较强的酸性可引起糖苷键断裂，形成较多的低聚糖，甚至单糖，进而使多糖含量降低，而还原糖含量升高N引。32真菌多糖的纯化321去蛋白粗多糖经去蛋白纯化后，其生物活性大大提高U引。去蛋白可采用SEVAG法、ICA三氯乙酸法和酶解法。其中，SEVAG法是实验室中常用的经典方法，用氯仿、正丁醇或正戊醇51VV混合后，加到样品水液中振摇，通过离心除去凝胶状蛋白质。该法不足之处是，工艺流程较长，有机溶剂耗量较大，而多糖损失较多。谢红旗等采用阴离子交换树脂脱除香菇多糖中的蛋白质，效果很好。322脱色素由于有些真菌的子实体或菌丝体中含有大量色素，因此粗多糖必须脱色。否则，不仅影响分光光度法测定含量的准确度，而且影响成品的品质。多糖脱色常常采用吸附法吸附剂有活性炭、纤维素、硅藻土、高岭土等，氧化法H202、离子交换法DEAE一纤维素离子交换柱、DUOLITEA一7等、金属络合法斐林试剂。323去除其他杂质经去蛋白和脱色素后，多糖中可能还含有其他杂质，可通过柱层析等方法除去；对于氨基酸、低聚糖等小分子化合物可采用半透膜逆向流水透析法除去。324分级沉淀目前，实验室常用以下几种方法L1。分部沉淀法采用不同浓度的甲醇、乙醇、丙酮等进行分部沉淀，达到纯化目的；季铵盐沉淀法常用的季铵盐试剂有十六烷基吡啶，十六烷基三甲基胺溴化物CRAB及其碱CTAOH；盐析法常用的盐析剂有NH42SO4、NAC1、KCI、CCOOK等；金属络合物法常用的络合试剂有氯化铜、醋酸铅、氢氧化铁、斐林试剂等。325应用现代技术主要包括柱层析法如凝胶柱层析、纤维素柱层析、纤维素阳离子交换树脂柱层析、高压液相柱层析等、超滤法、制备性电泳法等L1引。采用上述现代技术纯化多糖，效果好、纯度高。杨立红等在国内首次采用葡聚糖凝胶SEPHADEXG一200从杏鲍菇子实体中分离纯化出PEP一1与PEP一2两种多糖，为均具生物活性的葡聚糖。33真菌多糖的含量测定与纯度鉴定331含量测定多糖总量的测定方法有硫酸一蒽酮比色法，硫酸一苯酚比色法和间接碘量法。最常用的则是硫酸一蒽酮比色法，其原理是，在浓H2SO,作用下，多糖依次变为单糖、羟基糠醛，后者与蒽酮反应生成蓝绿色的糠醛衍生物在620NLN处有一最大吸收峰。在一定范围内，其颜色深浅与多糖含量成正相关。332纯度鉴定多糖纯度鉴定方法有N凝胶柱层析法，其原理是，由于多糖分子大小的差异，在柱中停留时间不同进行分离。依据多糖相对分子质量范围，选用凝胶型，通过检测洗脱液是否存在单一对称峰来判断多糖的纯度。如果经柱层析后只有一个对称的洗脱峰，即可认为被测多糖为单一组分的多糖448河北林果研究第24卷不含其他杂质。高压电泳法，此法较为直观，如果只有一条谱带，即可认定为纯多糖。此外，还有薄板层析法，聚丙烯酰胺凝胶电泳法、高压液相色谱法、凝胶过滤色谱法、超速离心法、旋光测定法等现代技术。比如，缪建等分别采用旋光测定法、SEPHAROSE柱层析、红外光谱法对香菇多糖的两种组分LEN1一A与LEN2一A进行纯度鉴定。最终确定，这两种组分为均一多糖组分。4真菌多糖的实际应用与研究展望41真菌多糖的应用作为一种重要的生物效应调节剂，真菌多糖具有非常广泛的药理作用，尤其在免疫调节，抗肿瘤、降血糖、降血压和降血脂，延缓衰老等方面的功效，使人们越来越重视其在医疗保健领域中的研发。目前，利用真菌多糖已开发出许多产品1香菇多糖注射液、羟甲基茯苓多糖注射液、猪苓多糖片、云芝泰康冲剂、猴头菇冲剂等，显示出广阔的应用前景。在临床上，真菌多糖已被广泛应用于免疫缺陷性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤类疾病的治疗。42扩大应用领域由于真菌多糖具有广泛的生物活性，除了用于疾病防治外，还可扩大应用领域，一是应用于食品行业，开发出具有保健功能的产品，提高人类的健康水平。二是应用于动物养殖业，开发出全新的绿色饲料添加剂。由于真菌多糖具有抗菌抗病毒、提高免疫力的功效和无毒、无残留、无污染的特点，完全符合绿色饲料和绿色养殖的要求。开展真菌多糖应用于饲料添加剂的研发，不仅具有广阔的市场潜力，而且具有深远的环保意义。43提供充足的原料要扩大真菌多糖的应用领域，必须以提供高质量的各种真菌原料作为根本保证。我国是农林大国，作物的秸秆、穗轴、谷壳、糠麸、林木的枝桠、边材和木材加工的锯末、下脚料等，均可作为这些食用真菌和药用真菌培养的辅料，这种“废物”利用可创造出令人瞩目的经济效益、社会效益和生态效益。参考文献1BAOXE，LIUCP，FANGJN，ETASTRTLETURANDINMMOLOGICALSTUDIESOFAMAJORPOLYSAEEHARIDEHNSPORES0FCANODERLUCDUMFRKARSTJCARBOHYDRATERESEARCH，2001，332167742恭敏，朱勤，王彤，等冬虫夏草多糖的分子结构与免疫活性J生物化学杂志，1990，664864913姜瑞芝，陈怀永，陈英红，等银耳孢糖的化学结构初步研究及其免疫活性J中国天然药物。2OO6。4173764RICEKG，WHPG，BRANDL，目2EXPERIMENTALDETERMINATIONOFOLIGOSAEEHARIDETHREEDIMENSIONALSTRUCTUREJJCURRENTOPINIONSTRUCTURALBIOLOGY，1993，356696745徐继英，胡庭俊，陈化琦，等银耳多糖化学特性与免疫调节机制研究进展J兽药与饲料添加剂，2OO6，114L8216MANTOVANILS，BELLINIME，ANGELIJF，DPGLUCANSINPROMOTIGHEALTHPRENERTTIONAGAINSTNJLTATIONANDCANCERLJJMUTATIEARESEARCH，20077187LLULLOYB，MPAS，CRAYESTRUCTUREANDFUNCTIONSTUDIES0FANTIEOLLANTSULPHATEDPOLYSACCHARIDEUSINGN崃JJOUMALOFBIOTECHNOLOGY，2OOO，7711231358刘伟，黄士良，赵建成植物多糖与免疫J生物学杂志，2OO3，2O4799沈萍萍，付庭治真菌多糖研究进展J南京大学学报自然科学版，1993，27352452910HAMUROJ，CHIHARAGMHANISLMOFACTIAOFAUTITUMORPOLYSAEEHARIDESIEFFECTOFANTILYMPHOEYTEEMMONTHEANTITUMACTIVITYOFLENTINAIL【JINTERNATIONALJOUMALCAL3EER，1971，81414611王专，张兰成，易华西，等几种真菌多糖的提取及生物活性J中国甜菜糖业，20062