细胞培养的操作步骤

细胞培养程序一、原代培养及其操作步骤原代分离细胞培养是指从体内取出组织，经过机器和消化，分成单细胞或单细胞群，在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当的温度和一定的营养条件下生存、生长和繁殖。原代培养细胞往往具有不同的细胞成分，生长速度慢，但更能表现出来源组织细胞的种类和表达组织的特定特征。最好利用原代细胞培养进行药物检查、细胞分化及病毒学等各种实验。程序如下：1.剪切组织用D-Hanks或Hanks溶液清洗确保的组织，去除表面的血液污染，用手术镊子附着的结缔组织等不可培养的组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成小块，转移到青霉素小瓶子或小烧瓶上，添加适量缓冲液，切成弯头眼科，反复切开，直到组织约1mm3大小。暂停后，用吸管吸上层，加入适当的缓冲液，再次清洗。2.消化分离消化分离用于将组织块消化分为细胞团或分散的单个细胞，帮助进一步培养，常用的消化酶是胰蛋白酶和胶原酶。培养的细胞悬浮使用计数板计算细胞数。最好用培养液将细胞数调整为(2 5) 105cells/ml，将实验所需的密度分成培养瓶，使细胞悬浮量复盖在培养瓶底部稍高的地方。CO2孵化器，5% CO2，37c静态培养。通常3 5d，原代培养细胞附着在瓶壁上开始生长，补充原培养液1/2的新培养液，2 3d后继续培养交换液，通常7 14d可以充满瓶壁并继承。4.注意事项(1)无菌操作：细菌或真菌污染是培养失败的常见原因，必须加强每个环节的无菌操作概念，以预防为主，一旦受到污染，大体上难以清除。(2)培养液：使用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类和组织类型不同，对培养液的要求条件稍有不同，必要时可以通过预先实验的方法选择适当的培养液。(3)小牛血清：小牛血清对维持培养细胞的生存和促进细胞增殖有重要作用。可以选择不同批号的小牛血清进行样品分析。一家制造商的犊牛血清确认后，作为实验用，原封不动地应用。(4)胶原酶溶液：要新鲜配制，保管时间过长(即使在-20低温下保管)，会影响消化效能，需要很长的消化时间，细胞损伤会增加。(5)L-谷氨酰胺：几乎所有细胞对谷氨酰胺的要求都很高，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，如果谷氨酰胺不足，细胞就会因生长不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，需要将含有谷氨酰胺的培养液放回4 的冰箱里保存2周以上。(6)培养停止：第一细胞在消化系统分离后，绝不能停留在CO2培养基的头部24 48h(必要时为72h)内，不要随时取出培养瓶观察繁育状况。这使得初级分离细胞很难粘在墙上，不能说扩张和增殖，初学者要特别注意。在培养液中，不必担心营养成分消耗光，在细胞增殖之前对营养的要求并不大。原代培养初期只添加薄层培养液的目的也有助于细胞黏附的扩大。(7)消化时间：微小的组织粒子一般用肉眼消化即可。此时组织颗粒已经松动，因此稍飞后成为细胞团或单个细胞，因为消化时间过长，细胞损伤增加，细胞培养存活率下降。(8)其他生长因子：如上处理后，一般的原代分离细胞培养可能成功。添加胰岛素等特定生长因子，一些特殊种类的细胞也能摄取葡萄糖和氨基酸。此外，内毒素、EGF、FGF等促进有丝分裂作用，但费用高。二、继代培养和操作阶段原代细胞培养成功后，需要分离培养。否则，细胞会因生存空间不足或密度过高而成为营养障碍，影响细胞生长。细胞原来在培养瓶内分离稀释后在新的培养瓶中培养的过程称为继代培养。传代细胞允许培养的细胞放大(细胞株形成)，可以复制细胞，保存容易，但也可能失去一些特殊的细胞和分化特性。继代细胞形成细胞系的最大意大利为便于实验提供了很多持续的实验物质。1.操作步骤(1)从培养瓶中吸出或倒入旧培养液。(2)在胰腺中加入少量胰蛋白酶溶液和EDTA混合物。最好能复盖培养瓶的底部。(3)在37 的孵化箱或室温(25 的温度)下，为消化放置25min后，将培养瓶倒放在显微镜下观察，细胞质收缩，细胞间距变大，应立即停止消化。(4)吸入消化液，在瓶子里放少量汉克斯液，轻轻转动培养瓶，冲洗剩余消化液，添加培养液。如果只消化胰蛋白酶，可以吸收胰蛋白溶液，然后添加少量含血清培养液，结束消化。(5)利用弯管吸管拉出瓶内培养液，依次反复轻吹瓶壁细胞，从瓶壁上脱落，形成细胞悬浮液。吹的时候要用力，以防止细胞过度损伤。(6)用计数板计数，分别接种到新的培养瓶，然后放入CO2培养箱内培养。-嗯？-嗯？-嗯？-嗯？(7)细胞培养交换时间取决于细胞生长的状态和实验要求。通常在2 3d后需要更换一次生长液。细胞装满碗的底部后，就可以使用了。也可以继续扩大培养或将培养换成维持液的过程。2.注意事项(1)掌握细胞消化的时间，消化时间太短的时候，不能远离病壁，消化时间太长的话，细胞会脱落，受损。(。(2)掌握消化浓度，如果消化液浓度太高，消化时间就要短，如果太低，细胞消化时间就会相对长。三、体内细胞培养和手术阶段1.肿瘤细胞悬浮接种(1)无菌选择性生长(光泽，浅红色)肿瘤组织或对数生长器官培养肿瘤细胞。(2)从PBS中切除肿瘤组织，然后用匀浆机研磨，通过80 100网眼屏过滤到细胞悬浮液中。(3)培养细胞用PBS冲洗两次。(4)将细胞浓度计算并调整为107 108/ml。(5)日常消毒后，将接种部位(通常是背部或腋下腹股沟皮下)用医用注射器皮下潜航，然后注入细胞悬浮液(0.1毫升/部位， 106细胞)。早期接种成功率低，细胞数尽可能多。(6)第二天观察动物的一般情况。早期接种大体上有较长的潜伏期，此后传代潜伏期逐渐缩短，固定在相对稳定的时间。2.腹水瘤的建立和腹水瘤的接种，将实体肿瘤细胞直接植入小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水。腹水中含有肿瘤细胞，重复腹水瘤可能成为腹水瘤。复仇在第一代经常表现血性(包含很多红细胞)，重复的复仇逐渐变成乳白色。腹水瘤接种过程如下：(1)离心和清洗冷冻或培养的腹水瘤细胞，计算细胞数。(2)消毒动物，106多个肿瘤细胞左下腹部穿刺接种。(3)接种腹水瘤细胞后，约712d，小鼠腹部肿大。用碘棉消毒鼠标腹部，用9号注射针提取腹水，使腹部解剖成为可能，然后用滴管吸收。每只鼠标可以抽3 5毫升。(4) 3000rpm离心15分钟提取的腹水，收集上部冷冻保管。四、培养细胞的冷冻保存和恢复细胞低温保存是培养室的日常工作和一般技术。细胞冻存-196液氮中储存时间几乎是无限的。细胞冷冻保存和复苏的原则是缓慢冻结和快速融化。1.冷冻保存细胞(1)对数增生期细胞(证明没有支原体污染，冷冻前改变1d液体。(2)用现有方法用悬浮液制造培养细胞，细胞密度约为5107/ml，离心，上等。(3)加入准备好的冷冻储藏液(培养液6.8毫升，小牛血清2毫升，DMSO 1毫升，5.6% nahco 3 0.1毫升)，按下一滴与去除相同的量，放入离心管，用吸管轻轻吹入，让细胞重新悬挂。冷冻细胞时，在培养液中添加10%二甲基亚砜(DMSO)或甘油，降低冰点，在细胞内水分冻结之前让细胞外渗出。(4)分灭菌冷冻保管管，在各管中加入1.5米悬浮液。(5)解开冷冻保管管，仔细检查，一定要盖上做标记。(6)冷冻储藏：在特殊仪器或简单的液氮容器中，按-1/min的速度下降到液氮表面30 40分钟，再停止30分钟，然后直接投入液氮。适当掌握下降冻结速度，太快会影响细胞内水分泄漏，太慢会促进冰晶的形成。戴上防护眼镜和手套以避免液氮冻伤。2.复苏细胞(1)从罐中取出冷冻保管管。(2)迅速加入36 37的水浴，迅速融化，在30 60s内完成。(3)用70%的冷冻保管管酒精消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬浮液注入离心管，然后