细胞培养基质量标准及检验方法

细胞培养基质量标准及检测方法中国医药生物技术协会2002年4月写说明一、根据中国医药生物技术协会于2010年9月20日组织的动物细胞培养基生产管理及质量控制学术研讨会个简档，根据我国实际情况制定本标准。二、本标准根据中国药典 2010版和哺乳类动物细胞培养基 (HG/T 3935-2007 )行业标准，符合生物产品对细胞培养基材的特殊要求制定，增加牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量等测定项目。三、本标准分为细胞培养基检测项目和各项检测方法，为评价细胞培养基产品质量提供依据和方法，规范了我国细胞培养基行业的健康发展。四、结果评定按照本标准和方法对细胞培养基样品进行全项检查，若所有项目均符合标准要求，该样品不符合判定合格的标准，则判定样品不合格。细胞培养基质量标准及检测方法一、细胞培养基的质量标准细胞培养基质量应满足表1所示的技术要求。表1技术要求检查项目限度的要求检查方法澄清度弄清楚中华人民共和国药典2010年版2部附录viib举行。pH值(每升的显示量/L )pH容许偏差范围为0.30在中华人民共和国药典2010年版附录vih中进行。渗透压力(mOsm/kgH2O )渗透压的允许偏差范围为5%采用中华人民共和国药典2010年版2部附录ix渗透压摩尔浓度测定法进行。干燥减量质量分率(% )5.0按照中华人民共和国药典2010年版2部附录viiil干燥减量测定法进行。内毒素(EU/ml )10按照中华人民共和国药典2010年版附录e细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。微生物限度细菌数量(CFU/g )200按照中华人民共和国药典2010年版附录j微生物限度检查法，检查项目为细菌数、霉菌数。 检查法采用平皿法。霉菌数(CFU/g )50细胞生长试验(vero细胞)细胞形态成纤维样张墙生长，形态正常无变异按照中华人民共和国化学工业标准哺乳类动物细胞培养基 HG/T 3935-2007第7.7条进行。细胞数培养72h细胞数为1105cells/ml以上，48h细胞数持续维持在1105cells/ml以上牛血清白蛋白检测不到根据中华人民共和国药典2010年附录牛血清白蛋白残留量检验法，不得检出牛血清白蛋白。抗生素检测不到根据中华人民共和国药典2010年附录viia抗生素残留量检验法，不得检出青霉素、链霉素及庆大霉素。二、检查方法除非另有说明，检查中只使用纯试剂和中华人民共和国药典2010年版规定的纯净水。2.1澄清度的测定取每升显示量的实验室样品，放入1万ml烧杯，加入950ml水，搅拌至溶解，补给至1 000ml水，均匀搅拌。 按照中华人民共和国药典2010年版2部附录viib进行。2.2 pH值的测定取每升显示量的实验室样品，放入1万ml烧杯，加入950ml水，搅拌至溶解，补给至1 000ml水，均匀搅拌。 按照中华人民共和国药典2010年版附录a进行。2.3干燥减量的测定根据中华人民共和国药典2010年版3部附录viil干燥重量减少测定法进行。2.4渗透压的测定取每升显示量的实验室样品，放入1万ml烧杯，加入950ml水，搅拌至溶解，补给至1 000ml水，均匀搅拌。 采用中华人民共和国药典2010年版3部附录h渗透压摩尔浓度测定法进行。将2次平行测定结果的算术平均值作为测定结果，2次平行测定结果的绝对差分值为这2个测定值的算术平均值的5%以下。2.5细菌内毒素的测定按照中华人民共和国药典2010年版附录e细菌内毒素检查法的凝胶法进行。2.6微生物限度的测定根据中华人民共和国药典2010年附录g微生物限度检查法，检查项目为细菌数、霉菌数。 检查法采用平皿法。2.7细胞生长试验2.7.1贴壁细胞生长试验2.7.1.1方法提供1 )本试验所用容器及溶液为无菌，试验操作过程为无菌操作。2 )细胞在37恒温条件下，在含体积分率为3%或10%的小牛血清的细胞培养液中生长72h，观察细胞形态进行细胞计数的细胞生长72h后，更换不含小牛血清的细胞培养液，继续48h培养，观察细胞形态，进行细胞计数。2.7.1.2试剂和材料1 )牛血清：相当于中华人民共和国药典2010年版3部附录d。2 )平衡盐溶液：将氯化钾称为0.2g，准确为0.01g磷酸二氢钾0.2g，准确为0.01g； 氯化钠8.0g，正确为0.01g无水磷酸氢二钠1.15g，正确为0.001g； 加入1万ml纯净水，混合，测定pH值，pH值为7.50.3，过滤除菌即可。3 )细胞： vero细胞(或根据不同细胞培养基的种类适应的细胞) :细胞代在150代以下。4 )细胞培养液：根据产品使用说明书的要求制备3 )胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶(1:250)2.5g，准确调至0.01g，加入平衡盐溶液1万ml，均匀测定pH值，用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节pH值，除菌后即可得到。2.7.1.3设备1 )医用洁净台：洁净水平为百级2 )二氧化碳恒温孵化器：可通过二氧化碳气体，使二氧化碳体积分率保持在(50.1)%，在(371)下恒温。3 )细胞培养瓶： T25型，无菌。4 )显微镜：跌倒差异。5 )血球计数板。6 )玻璃盖：无水乙醇浸泡，擦拭干净。2.7.1.4测试程序1 )制备细胞悬浮液a取生长成致密单层的细胞种子，从细胞培养瓶中取出原细胞培养液，用适量的平衡盐溶液洗涤细胞一次，丢弃洗涤液(死细胞除外)。在b细胞培养瓶中加入胰蛋白酶溶液1ml，消化一定时间，用显微镜观察，细胞变圆接近脱壁后丢弃胰蛋白酶溶液。根据c细胞数加入一定量的细胞培养液，用吸管喷射，使细胞脱壁，制成细胞悬浊液a。2 )细胞培养a吸取一定量的细胞悬浊液a，放入细胞培养瓶中。在b细胞培养瓶中加入含有体积分率为3%或10%的小牛血清的细胞培养液10ml，使细胞接种数为5104细胞/ml。将c细胞培养瓶放入培育箱中，在(371)温度条件和(50.1)%二氧化碳条件下培养。d培养72h，观察细胞形态，按2.7.1.4步骤1 )的方法制备细胞悬浮液，进行活细胞计数。e培养72h后，更换不含牛血清的细胞培养液10ml，继续培养48h，观察细胞形态，按照2.7.1.4试验步骤1 )的方法制备细胞悬浊液，进行活细胞计数。3 )细胞数a按照2.7.1.4步骤1 )的方法制备细胞悬浊液b。吸收b细胞悬浊液B100l转移到离心管，根据细胞量决定稀释及稀释倍率。将c盖玻璃盖在计数板中心的计数室上。 将计数板中的细胞数调整为(100300 )个。 沿玻璃盖边加入细胞悬浮液，通过毛细管现象自然渗透，不能留下气泡，不能溢出，用显微镜计数。观察d计数板四角大眼的细胞数，细胞压迫中线时，一般遵循“不计数，不计数”的原则。 将计数板的观察细胞数代入下式计数板观察细胞数104稀释倍数/4=细胞数/ml2.7.1.5分析结果的表现培养72h细胞，细胞形态正常，活细胞数量不得少于1105个/ml。 持续培养48h的细胞形态正常，活细胞数必须在1105个/ml以上。2.7.2悬浮型细胞生长试验2.7.2.1方法提要本试验所用容器及溶液为无菌，试验操作过程为无菌操作。细胞在37恒温条件下在细胞培养液中漂浮生长72h，观察细胞形态，进行72h细胞计数。2.7.2.2试剂和材料1 )细胞：适用于检测对象细胞培养基的浮游细胞株。2 )细胞培养液：根据产品使用说明书的要求配制2.7.2.3设备1 )医用洁净台：洁净水平为百级2 )恒温振动培养箱： 371)可恒温3 )细胞培养瓶： 250ml摇瓶，应无菌4 )显微镜：跌倒、不同2.7.2.4细胞培养1 )用方瓶或摇瓶扩增细胞2 )用离心细胞、测定对象细胞培养液悬浮细胞，进行计数，算出必要的细胞数3 )将细胞转移到小瓶中，细胞数的接种数为2.5105个/ml，加入液体的量为20ml左右4 )将摇瓶细胞转移到恒温培养罐中培养，转速90100rpm，温度37；5 )培养5)72h，记录细胞数和活性率(采用0.4%的台盼蓝染色法，计算活性率)。2.7.2.5细胞活性率的计算1 )细胞染色：取一根吸管，放入培养瓶中，轻轻重复喷射细胞悬浮液使细胞均匀悬浮后，立即稍微吸入细胞悬浮液，在另一根离心管中滴入1份细胞悬浮液，在台上滴入1份蓝色染色液，混合，放置23分钟。2 )计数：按照2.7.1.4步骤1 )进行。 镜下观察，细胞分散，健康细胞完整，透明无着色，着色细胞均为死亡细胞。 记录活细胞数和细胞总数。3 )活性率计算细胞活性率%=(活性细胞数/细