细胞培养工作流程

细胞培养工作流程一、Vero细胞恢复过程1，准备1.1检查工作地点：请确认台面、地面是否干净，并确认所有相关物品。1.2设施检查：确认空调、传送窗口工作状态良好。准备1.3层流罩：打开层流罩，观察正常工作，用消毒剂对台面、墙、地板、保护窗帘和层流罩内部设备进行清洁消毒。30分钟后开始生产工作。1.4操作工具和试剂检查：检查此次作业中使用的灭菌物品的包装是否紧密，是否在有效期内。确认此操作中使用的溶液/试瓶内是否有异物，瓶子表面是否有裂纹，瓶盖是否松动，溶液名称、批号、数量和有效期是否符合要求。合格后用消毒液擦拭外部表面，然后放入层流罩。复苏、交换用液体：MEM液体、新生儿牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3溶液。1.5恢复用水准备：(1)熔化种子用溶液：按1L/1种子，391 含有0.1%的尼日尔消化溶液。(2) 100级消毒种子数：1L/1种子制备36.510.1%尼日尔消化液。1.6操作员进入层流罩：穿上灭菌跳跃服，戴上灭菌手套，停止5分钟后才能工作。1.7溶液使用预处理：辅助人员用止血钳钉上酒精棉棒点火，对瓶盖外表面消毒，旋转一周，工人翻转塞子，然后用点燃的酒精棉棒消毒瓶口和瓶盖。2，扣环制模复苏液MEM增长液名字附加量(ml)内容控制范围附加量(ml)内容控制范围MEM徽章溶液100/300/新生儿牛血清109%到10%154.5%到5.5%3%谷氨酰胺溶液10.9%到1%30.9%到1%庆大霉素0.10.12%到0.13%0.40.12%到0.13%7.5%NaHCO31.51.5%到1.8%4.51.5%到2%助手将配方所需的液体依次打开，放在盐水瓶架上，操作者根据配方依次使用吸管，将新生儿牛血清等溶液放入MEM液体中，吸完各液体后立即使用灭菌瓣插头密封，并用瓶内标记标记显示使用情况、日期等。配合复苏液和生长液后，辅助人员立即使用杀菌的皮瓣塞，拧紧，充分混合使用。辅助人员打开混合好的恢复液，放在盐水瓶架上。工人打开培养瓶(T175)盖子，在酒井灯附近倾斜或直立，将恢复液吸入吸管，或直接倒入(加：0.3 0.4ml/cm2)，拧紧瓶盖，放在恒温室中使用。3，种子kinex按种子银行管理规定领取，按生产指示按数量领取。该操作规范规定了从一个细胞种子到一个T75 cm2瓶的每个操作。如果领子数量变化培养瓶面积按比例调整，后续工作各使用量将按比例调整。4、种子即时种子库管理员刚从细胞库取出细胞种子时，在液态氮场颈部停留数秒，检查每个领子的种子标签内容是否与细胞种子申报单上的内容一致。检查后，在391 迅速全部浸泡，含有0.1%的尼日尔消化液(1000毫升/盆种子)，在融化前继续顺时针摇晃，控制每个速融时间在1分钟以内。然后用75%的酒精消毒容器内的外部表面，在传递窗内通风2分钟。通知细胞职员从传递窗口拿走种子。在100级36.51 下，迅速输送0.1%的尼日尔消化溶液并浸泡，100级内部工作人员将去除并烘干。5、物种迁移工人左手拿着冷冻保管管，右手打开，用1毫升的吸管吸入融化的细胞种子，将慢速滴放入T75 cm2培养瓶，拧紧瓶盖。6、训练辅助人员将细胞名称、批号、世代、恢复日期、病号等列在培养瓶上，然后及时安排温控器定植培养。液体在24小时内被替换(80%的附着细胞)。7、厅长将废液倒入下水道，要清理的物品从输送窗口传送到粗糙的洗衣间，在层流罩中用75%的酒精消毒后，用纯净水清洁整个房间。8、恢复后观察第二天用显微镜观察培养液颜色(PH)是否正常，细胞形态的数量。9、交换兑换准备和恢复前一样。看看培养液颜色是否正常，是否有泄漏，细胞是否生长良好。用消毒药擦拭表面后，放入层流罩，工人进入层流罩，更换灭菌软体服后，需要静置5分钟才能工作。辅助人员用酒精棉棒消毒软木外面，操作人员打开塞子，用火焰消毒乳头和瓶盖。工人用右手抓住培养瓶底部，用左手松开瓶盖，轻轻翻转培养瓶，使上清液沿其顶部流向肺液缸。辅助人员决定打开包含生长液的瓶口，将火焰旋转一圈，然后放在盐水瓶架上使用。工人拧下培养瓶塞子，放在酒井灯附近，用吸管吸出生长液，或直接倒入(量：0.3 0.4ml/cm2)。拧紧瓶盖，平放在温度调节器上培养。最后按规定整理章节第二，细胞系结过程1，准备1.1检查工作地点：请确认台面、地面是否干净，并确认所有相关物品。1.2设施检查：确认空调、蠕动泵运行状态良好。准备1.3层流罩：打开层流罩，观察正常工作，用消毒剂对台面、墙、地板、保护窗帘和层流罩内部设备进行清洁消毒。30分钟后开始生产工作。1.4操作工具和试剂检查：检查此次作业中使用的灭菌物品的包装是否紧密，是否在有效期内。确认此操作中使用的溶液/试瓶内是否有异物，瓶子表面是否有裂纹，瓶盖是否松动，溶液名称、批号、数量和有效期是否符合要求。合格后用消毒液擦拭外部表面，然后放入层流罩。细胞替代液：MEM液体、新生儿牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3溶液、0.01MPBS溶液、细胞消化液(包括0.25%胰蛋白酶溶液)。2、使用第一代2.1循环制模MEM增长液名字附加量(ml)内容控制范围MEM徽章溶液400/新生儿牛血清204.5%到5.5%3%谷氨酰胺溶液40.9%到1%庆大霉素0.50.12%到0.13%7.5%NaHCO381.8%到2%在MEM中依次添加新生儿牛血清，3%谷氨酰胺溶液，庆大霉素，7.5%NaHCO3。辅助人员将瓶盖拧紧，在瓶身上标明使用量和日期等，并均匀混合。注意：无菌吸管不要触摸尾部以外的任何地方。否则，请勿使用。2.2洗涤助手打开PBS，用酒精灯消毒瓶口，然后放入盐水架使用。工人打开培养瓶，将上清液沿着培养瓶的顶面倒入废液桶。然后将PBS倒入酒灯旁的培养瓶中，倒入羊：30毫升/T75 cm2瓶。加：0.2-0.4ml/cm2)盖上盖子，PBS用助手把盖子盖上，表示使用情况、日期。(。工人前后摇晃了一下培养瓶，然后滴落PBS。注意：倒入废液时，要注意不要污染瓶盖。2.3消化助手打开消化液瓶盖，用火焰消毒瓶盖，然后放在盐水架里使用。还打开培养瓶盖，交给操作员。工人用吸管将3ml细胞消化液吸在培养瓶底部，(添加消化液：0.020.04 ml /cm2)盖上瓶盖。辅助人员盖上消化液，显示剂量，日期。工作人员将培养瓶翻转，将细胞消化液装满整个细胞面，等待细胞间质松动，翻转培养瓶，将消化液盐沿着培养瓶上倒入废液桶，盖上盖子，在36.50.5 恒温或室温下持续作用5 10分钟。注意：细胞培养瓶最好在盖子打开后倾斜45度，操作完成后立即盖上盖子。在室温下消化细胞的时候，肉眼观察细胞面是针孔的时候，要浇上细胞消化液，防止细胞脱落。2.4悬浮液准备助手打开生长液，用火焰消毒，然后放在盐水架里使用。工人打开容易消化的培养瓶，用吸管吸10毫升到T75 cm2瓶，用吸管冲洗细胞，均匀地制造细胞悬浮液。注意：要充分分散细胞，用肉眼观察，没有肿块。2.5种工作人员将细胞悬浮液平均种在2个T175 cm2培养瓶上，生长液最多种到75ml。2.6培养辅助人员将细胞批号、世代、传代比例、病号、日期标记在2个T175 cm2细胞培养瓶上，将接种细胞的培养瓶放置在温度调节培养室进行培养。2.7厅长按规定整理章节2.8观察每天观察细胞生长状态3、使用第二代3.1循环制模MEM增长液名字附加量(ml)内容控制范围MEM徽章溶液600/新生儿牛血清304.5%到5.5%3%谷氨酰胺溶液60.9%到1%庆大霉素0.750.12%到0.13%7.5%NaHCO3121.8%到2%在MEM中依次添加新生儿牛血清，3%谷氨酰胺溶液，庆大霉素，7.5%NaHCO3。辅助人员将瓶盖拧紧，在瓶身上标明使用量和日期等，并均匀混合。注意：无菌吸管不要触摸尾部以外的任何地方。否则，请勿使用。3.2洗涤辅助人员还打开PBS，用酒精灯消毒瓶口，然后放在盐瓶架上使用。工人打开培养瓶，将上清液沿着培养瓶的顶面倒入废液桶。然后将PBS倒入啤酒厂瓶子，定量倒入60ml/T175 cm2瓶。加：0.2-0.4ml/cm2)盖上盖子，PBS用助手把盖子盖上，表示使用情况、日期。(。工人前后摇晃了一下培养瓶，然后滴落PBS。注意：倒入废液时，要注意不要污染瓶盖。3.3消化助手打开消化液瓶盖，用火焰消毒瓶盖，然后放在盐水架里使用。还打开培养瓶盖，交给操作员。操作者用吸管将7ml细胞消化液吸到培养瓶底部，(添加消化液：0.020.04 ml /cm2)盖上瓶盖。辅助人员盖上消化液，显示剂量，日期。工作人员将培养瓶翻转，将细胞消化液装满整个细胞面，等待细胞间质松动，翻转培养瓶，将消化液盐沿着培养瓶上倒入废液桶，盖上盖子，在36.50.5 恒温或室温下持续作用5 10分钟。注意：细胞培养瓶最好在盖子打开后倾斜45度，操作完成后立即盖上盖子。在室温下消化细胞的时候，肉眼观察细胞面是针孔的时候，要浇上细胞消化液，防止细胞脱落。3.4悬浮液准备助手打开生长液，用火焰消毒，然后放在盐水架里使用。工人打开容易消化的培养瓶，将生长液直接倒入T175 cm2瓶，用吸管冲洗每瓶量：75毫升，将细胞吹散，形成均匀的细胞悬浮。注意：要充分分散细胞，用肉眼观察，没有肿块。3.5种工人将细胞悬浮液均匀地种在8个T175 cm2培养瓶上，增加了生长液到75ml。3.6培养辅助人员将细胞批号、世代比例、病号、日期标记在细胞培养瓶上，将接种细胞的培养瓶放入温度调节培养室进行培养。3.7厅长按规定整理章节3.8观察每天观察细胞生长状态4、使用第三代4.1循环制模MEM增长液名字附加量(ml)内容控制范围MEM徽章溶液2000/新生儿牛血清1004.5%到5.5%3%谷氨酰胺溶液200.9%到1%庆大霉素2.50.12%到0.13%7.5%NaHCO3401.8%到2%辅助人员首先要用酒精棉棒消毒MEM桶入口，解开盖子，工作人员要解开线，将外部包装纸翻出来，露出通过的瓶盖顶部，右手抓住连接的空气过滤器和排气口管道，左手松开包装袋，一次取出管子，放进MEM桶，辅助人员要继续将点亮的酒精棉棒放在桶附近，创造无菌环境。辅助人员依次打开所需的溶液，利用液管将溶液吸入MEM桶，然后混合使用。然后拔出直管，连接有细胞工厂连接器的不锈钢管，供使用。注意：使用消毒吸管时，请勿靠近其他部分(吸管背面的任何位置除外)。如果不小心撞上了，必须立即销毁。安装管道时，不小心撞到其他部分的管道必须立即报废。4.2洗涤助手打开PBS，用酒精灯消毒瓶口，然后放入盐水架使用。工人打开培养瓶，将上清液沿着培养瓶的顶面倒入废液桶。然后将PBS倒入啤酒厂瓶子，定量倒入60ml/T175 cm2瓶。加：0.2-0.4ml/cm2)盖上盖子，PBS用助手把盖子盖上，表示使用情况、日期。(。工人前后摇晃了一下培养瓶，然后滴落PBS。注意：倒入废液时，要注意不要污染瓶盖。4.3消化助手打开消化液瓶盖，用火焰消毒瓶盖，然后放在盐水架里使用。还打开培养瓶盖，交给操作员。操作者用吸管将7ml细胞消化液吸到培养瓶底部，(添加消化液：0.020.04 ml /cm2)盖上瓶盖。辅助人员盖上消化液，显示剂量，日期。工作人员将培养瓶翻转，将细胞消化液装满整个细胞面，等待细胞间质松动，翻转培养瓶，将消化液盐沿着培养瓶上倒入废液桶，盖上盖子，在36.50.5 恒温或室温下持续作用5 10分钟。注意：细胞培养瓶最好在盖子打开后倾斜45度，操作完成后立即盖上盖子。在室温下消化细胞的时候，肉眼观察细胞面是针孔的时候，要浇上细胞消化液，防止细胞脱落。4.4悬浮液准备助手打开生长液，用火焰消毒，然后放在盐水架里使用。工人打开容易消化的培养瓶，将生长液直接倒入T175 cm2瓶，用吸管冲洗每瓶量：75毫升，将细胞吹散，形成均匀的细胞悬浮。然后将8个培养瓶的细胞合并成1个T175 cm2瓶。用液体输送管吸入MEM，好好搅拌。注意：要充分分散细胞，用肉眼观察，没有肿块。4.5种助手打开10层细胞工厂的盖子，工人将连接到管道排出口的细胞工厂连接器在无菌状态下对接到细胞工厂的左边端口，然后将细胞工厂穿过操作台，松开细胞工厂右端的盖子。辅助剂真空泵空气泵连接到空气过滤器，打开真空泵，将生长液推进细胞工厂。完成后，用止血钳固定管子，拧紧细胞工厂右端的盖子，使细胞工厂保持平衡，将细胞工厂直立，去掉连接左端细胞工厂管道的接头，用盖子关闭右侧细胞工厂接口，使细胞工厂变平。然后将管道残夜放入准备好的T25 cm2培养瓶中进行对照。注：加