细胞工程—动物细胞培养细节复习题1VIP

动物细胞原代培养技术细节1、原代培养：从机体中取出后立即培养的细胞为原代细胞。 该方法可观察细胞分裂繁殖、细胞接触抑制、细胞老化、死亡等生命现象。2、继代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，制备细胞悬浊液，分成两个以上的培养瓶继续培养，称为继代培养。3 .无菌操作基本技术：3.1实验前，无菌室和无菌工作台(laminar flow )照射紫外线30-60分钟灭菌，70 %ethanol擦拭无菌工作台，无菌工作台风扇运转10分钟后，开始实验作业。3.2一次操作只处理一株细胞株，即使培养基相同也不共享培养基，避免错误的混淆和细胞间的污染。3.3实验结束后，将实验品从工作台拿出，用70 % ethanol擦拭无菌操作的提升面。 操作间隔为无菌作业台运转10分钟以上后，进行下一个细胞株的操作。3.4无菌操作区应清洁宽敞。 必要的物品，例如试管架、吸管吸引器和吸管盒等可以暂时放置，其他实验用品用完后移动，有利于气流的流通。3.5实验用品用70 % ethanol擦拭后，送入无菌作业台。 实验操作是桌子中央的无菌区域，不得在边缘的无菌区域操作。3.6慎重取无菌实验品，避免污染。 请勿触摸吸管的前端或瓶口，也不要在打开的容器正上方进行实验。 容器打开后，用手夹住盖子拿住身体，倾斜约45度取出，盖子口朝上，不要放置桌子。3.7工作人员应注意自己的安全，戴上实验服和手套后再进行实验。 对于从人或病毒感染的细胞株，应该特别小心操作，选择适当等级的无菌操作台(至少Class II )。 应注意毒性药品如DMSO和TPA等，避免在操作过程中产生aerosol，避免严重的针头损伤等。3.8定期检查下列项目： CO2储气瓶的CO2压力CO2培养箱的CO2浓度、温度以及水盘有无污染(水盘的水为无菌水，每周更换)。 无菌工作台内的airflow压力定期更换紫外线灯和HEPA过滤膜、预过滤器(300小时/预过滤器、3000小时/HEPA )。4 .培养基4.1液体培养基贮藏在4的冰箱中，避免光照，实验前放入37的水槽中加热。4.2液体培养基(加血清)保存期为6个月，期间谷氨酰胺可能分解，细胞生长不良时可添加适量谷氨酰胺。4.3粉末培养基的制备(注意): 细胞培养基通常添加10 %血清，pH为7.2 - 7.4 . 粉末培养基和NaHCO3粉末分别溶解后混合，用CO2气体调节pH，而不是强酸(HCl )或强碱(NaOH )。 因为氯离子有影响细胞生长的可能性，储藏时培养基的pH容易变化。 纯水调制。 用0.1或0.2 mm无菌过滤膜过滤灭菌。 显示培养基的种类、日期、瓶号等，贮藏在4。 必须进行生长试验和污染试验。5 .抗生素5.1 .细胞库的细胞培养基不加抗生素5.1.1 .培养ATCC引入的细胞株，培养基中不添加抗生素。5.1.2 .培养从其他实验室导入的细胞株，必须添加抗生素。 token freeze通过污染测试后大量培养，不添加抗生素。5.2 .输送活细胞时，如果培养液必须充满整个培养瓶，则添加抗生素(青霉素100 units/ml链霉素100 ug/ml )。5.3 .检测支原体不得在培养基中添加庆大霉素。 庆大霉素抑制支原体生长。6、血清：-20或-70至4冰箱溶解1天，在室温下完全溶解后分注，通常可用50 ml无菌离心管分注4045 ml。 溶解过程中必须使规律摇摆(注意不要产生气泡)的温度和成分均匀，减少沉淀的发生。 请勿将-20直接解冻至37。 因为温度变化太大，蛋白质很容易凝结沉淀。7 .血清沉淀物7.1 .凝聚物：发生的原因有很多，但一般原因是血清中脂蛋白(lipoprotein )的改性和解冻后血清中存在的纤维蛋白(fibrin )，这些凝聚沉淀物不影响血清本身的质量。7.2显微镜观察到的“黑点”:通常热处理的血清中，沉淀物的形成显着增加。 有些沉淀物用显微镜观察“黑点”，一般来说，这个黑点应该不会影响细胞的生长。8、细胞冷冻保存注意事项：8.1 .待冷冻保存的细胞生长良好，存活率高，密度约为80 - 90 %。8.2 .冷冻前检查细胞是否仍具有固有性质。 例如hybridoma从冷冻保存的前一天到两天前要检查抗体的产生。8.3 .注意冷冻保护剂的质量。 DMSO为试剂水平，无菌且无色，应以510 ml的小体积分注，4避光保存，不可多次解冻。 甘油也在试剂水平，用高压蒸汽灭菌后，应避光保存。 开封后1年内使用，长期保存后对细胞有毒性。9 .冷冻细胞的活化：1.快速解冻(轻轻摇动冷冻管1分钟以内全部溶解)，冰晶重结晶对细胞造成损伤，避免导致细胞死亡。 2 .细胞激活后数日或继代后两代，其细胞生长和特性恢复正常(如产生单株抗体和其他蛋白质)。 解冻后是否立即除去冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol )取决于细胞的种类，通常不需要立即除去冷冻保护剂。 解冻培养后每隔一天更换培养基大格*细胞总数x 2 x 104/4=细胞数/ml1冷冻管应该怎么解冻？取出冷冻管后，立即放入37 C水槽迅速解冻，轻轻摇动冷冻管1分钟以内使其全部溶解，如果不注意水面不要超过冷冻管盖的边缘，容易引起污染。 另外，从液氮罐中取出冷冻管解冻时，要注意安全，防止冷冻管破裂。2细胞冷冻管解冻培养时，应立即清除DMSO吗？除非特别注明对DMSO敏感的细胞，否则大多数细胞株(包括漂浮性细胞)解冻后放入含10-15ml新鲜培养基的培养方瓶中，次日置换新鲜培养基除去DMSO即可，避免解冻后细胞不能生长或粘贴的问题。3可以使用不同于传统培养条件的培养基吗？做不到。 每个细胞株都有适应其特定使用的细胞培养基，突然使用与以前提供的培养条件不同的培养基，多数细胞不能立即适应，细胞不能生存。4可以使用不同于传统培养条件的血清种类吗？做不到。 由于血清是细胞培养中极为重要的营养来源，因此血清的种类和质量对细胞的生长有很大影响。 来自不同物种的血清，根据某种物质和分子的量和内容物的不同而不同，由于血清的使用错误，细胞无法生存的情况较多。什么是FBS、FCS、CS和HS？FBS (fetal bovine serum )和FCS (fetal calf serum )是同意的，都是指胎牛血清，FCS是错误的用语，请不要使用。 CS (calf serum )指犊牛血清。 HS (horseserum )指马血清。6培养细胞需要使用5 %或10% CO2吗？ 没有影响吗？一般培养基中HCO3-/CO32-/H作为pH的缓冲体系，培养基中NaHCO3的含量决定了应用于细胞培养的CO2浓度。 培养基中NaHCO3的含量为每升3.7 g时，细胞培养使用10 % CO2，培养基中的NaHCO3为每升1.5 g时，使用5 % CO2培养细胞。7什么时候更换培养基？根据细胞的生长密度或细胞株基本数据上的交换时间，按时交换培养基即可。8培养基需要添加抗生素吗？除了特殊的筛选系统外，在正常培养状态下，不得向培养基中添加抗生素。9附着性细胞的传代中使用的trypsin-EDTA浓度是多少？ 我该怎么办？一般使用trypsin-EDTA浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA . 首次打开瓶子后立即少量注入无菌试管，保存于20 c，避免反复冷冻解冻降低trypsin活性，减少污染机会。10悬浮细胞应该怎样处理？一般来说，只要继续新鲜的培养就可以根据原来的培养方瓶稀释细胞浓度，培养液过多的话就会稍微抬起培养方瓶的口端直到不能收容为止。 分瓶时将含细胞培养液的一部分取出另一个新培养方瓶，加入新培养基稀释至适当浓度，重复上述步骤即可。11一般的动物细胞要离心，其离心速度必须是多少？试图回收动物细胞，其离心速度一般为300xg (约1，000 r pm )，5 - 10分钟，转速过高会导致细胞死亡。12细胞的接种密度是多少？只要以基于细胞株基本数据的接种密度和稀释分盘的比例进行接种即可。 细胞数量过少、稀释过多也是细胞无法生长的重要原因之一。13细胞冷冻培养基的成分是什么？动物细胞冷冻保存最常用的冷冻培养基是DMSO(dimethylsulfoxide )为510%，活细胞生长用新鲜培养基为90 - 95 %均匀混合而成的。 注意：为了在DMSO稀释时释放大量的热能，DMSO在使用前必须调制，不要直接放入细胞液中。14 DMSO的等级和无菌过滤方法是什么？用于冷冻保存的DMSO等级必须是Tissue culture grade的DMSO(sigmad2650等)，其本身处于无菌状态，首次打开瓶子后立即少量注入无菌试管，保存在4C中，通过反复冷冻解冻，使DMSO分解，不释放有害物质，污染过滤DMSO时，使用对DMSO具有耐性的尼龙制过滤器。15如何冷冻保存细胞？冷冻保存方法：冷冻管4 C 3060分钟 (-20 C30分钟*) -80 C 1618小时(或夜间)液氮浴长期保存。冷冻保存方法：冷冻管放入设定的可编程降温机中，每分钟从1-3 C下降到-80 C以下，放入液氮浴中长期保存。 *-20 C不得超过1小时，以防冰晶过大导致细胞大量死亡。 也可以跳过这个步骤直接放入-80C冰箱，但生存率稍有下降。 适用于悬浮型细胞的保存。16细胞试图冷冻保存时，细胞冷冻管内的细胞浓度是多少？冷冻管内细胞数一般为每根1x106 cells/ml，融合肿瘤细胞最好为每根5x106 cells/ml。17怎样避免细胞污染？细胞污染的种类分为细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉菌。 主要污染原因包括无菌操作技术不完善、操作室环境不良、被污染血清和被污染细胞等。 严格的无菌操作技术，清洁环境，制备优质细胞源和培养基是减少污染的最佳方法。18如果细胞发生微生物污染，应如何处理？加入抗生素。 直接灭菌后扔掉了。19支原体(mycoplasma )污染的细胞，用肉眼可以观察异常吗做不到。 除了有极大经验的专家外，大多数被支原体污染的细胞株的外观是无法辨别的。20支原体污染对细胞培养有什么影响？支原体污染几乎影响所有细胞的生长参数、代谢和研究数据。 因此，在进行实验之前，必须确认细胞是mycoplasma-free，对实验结果的数据方面有意义。如果21细胞株检测出支原体污染，该怎么办？直接灭菌后废弃，以免污染其他细胞株。22 CO2培养箱的水盘怎样保持清洁？定期(至少每2周)用无菌蒸馏水或无菌去离子水进行更换。23培养基为什么保存在4 C冰箱里，颜色变暗变红，pH变碱为什么？培养基保存在4 C冰箱中，培养基内的CO2逐渐溢出，培养基越来越碱性。 培养基中酸碱指示剂(通常为phenol red )的颜色也随着碱性的增加而变得更暗的红色。 培养基的碱偏倚的结果是细胞的成长停滞或死亡。 培养基偏向碱时，通过无菌过滤的CO2，调整pH值。24各种细胞培养用的dish、flask是一样的吗不同厂家的dish和flask制造工艺因coating的polymer而异，对大多数细胞没有大的影响，但是不同厂家的dish和flask可能会有显着的生长差异。25购买的细胞冷冻管解冻后，为什么细胞数少？研究人员培养冷冻细胞时细胞数量之所以少，是因为离心过程操作失误，细胞物理损伤，细胞流失。 建议细胞解冻后不要立即离心，细胞生长后夜间更换培养基即可。26购买的细胞死亡，细胞存活率可能恶化的原因是什么？研究人员在细胞培养时存活率差，常见的原因是培养基使用失误和培养基质量差。 血清使用失误或血清质量差。 解冻过程不对。 冷冻细胞解冻后，清洗细胞，离心。 浮游细胞误认为死亡细胞。 培养温度使用错误。 细胞放在80c上太多了。27收到的冷冻管的壳体破裂，盖子出现裂纹，盖子脱落的原因是什么？冷冻管的盖子破裂、壳体破裂，也许是因为操作者在夹住冷冻管时力量不足，冷冻管破损了。 建议使用止血钳小心把持。 另外，冷冻管的盖松动或松动是热膨胀收缩的物理现象，冷冻管有可能引起细胞污染，因此在将冷冻管放入液氮罐或取出液氮罐时，必须立即再次紧固冷冻管28如何选择特殊细胞系培养基？培养某种细胞没有一定的培养条件。 用MEM培养的细胞在DMEM和M199中也很容易成长。 总之，MEM优选附着细胞培养，RPMI-1640优选浮游细胞培养，无血清培养优选AIM V(12005 )培养基(SFM )。29l谷氨酰胺在细胞