细胞污染及处理方法

细胞污染及处理方法总结洁净区，并不是没有细菌，而是细菌的数量非常少，国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1个每培养皿.而国外的标准比我国的还要高一点，要求的数量更少。所以在我们的洁净操作台里，并不是真正一个细菌都没有的，所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌的数量。所以处理细菌污染的重要原则就是：无限地稀释细菌的浓度，无限地减少细菌的数量！1、 细菌污染培养基：颜色发红，液体清亮或浑浊；显微镜下：有黑点或杆状物在到处游走，细胞部分脱落，出现细胞碎片；成像：图一：杆菌污染图二：白色链球菌以下是摘自丁香园的处理方法：1） .将污染的培养液倒掉，转烧瓶口，加入10mlPBS，适当晃动清洗培养瓶，然后倒掉。转烧瓶口。2） .继续加入10mlPBS，同样方法晃动，清洗培养瓶，然后倒掉。3） .继续加入5mlPBS，同样方法洗瓶，主要是培养面，然后倒掉。4） .重复步骤3再洗。5） .重复步骤3再洗。6） .加入3-5ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。7） .加入3ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。8） .再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。9） .加入10ml培养液，加入2ml双抗，放置培养箱培养，5小时之后，倒掉培养基，加入PBS洗瓶两次，然后加入胰酶消化，吹打后置于离心机800-1000r/min离心，然后洗一次。置于新的培养瓶里培养，培养体系加入2ml双抗。10） .24h之后，视情况换液，若仍然污染严重，培养基浑浊，重复以上步骤，若看不到污染物，则继续步骤1)、3）、4）、6）、8），然后加入培养液培养，培养体系加入2ml双抗.11） .24h之后，若仍污染严重，可再重复一次，若还污染只能弃之（不过一般没有出现这种情况），若镜下不见污染物，则换液PBS洗瓶，正常培养。（常见为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）若细胞状态极差，尽早处理掉细胞，并找出污染源，对培养箱，生物安全柜，细胞房进行消毒处理。2、 真菌污染培养基：有的培养液清亮，不变色；显微镜下：有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。成像：图三：看上去像白色念珠菌污染处理方法：若为霉菌或者真菌污染，加入两性霉素B清洗和培养，终浓度一般为2.5g/ml（在30g/ml时会有细胞毒性）。另外也可以选择在培养基里加3ug/ml的制霉菌素或放线菌素D。其它操作同细菌。3、 霉菌污染培养基：培养液是清亮的；显微镜下：絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差；成像：处理方法：预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；（原来我们这里也有霉菌感染的，不过后面在培养基里加上了0.5的大福康（原来的双抗各改为0.25的青霉素和链霉素）摘自丁香园），效果还可以！你可以试试！但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作 。霉菌污染多来自空气,所以做实验时说话聊天,或瓶口敞开时间太长,还有培养箱开关频繁是主要原因,还是多找自身原因. 4、 支原体污染支原体污染后，不会立即使细胞死亡，可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞收到多方面潜在影响，如引起细胞变形， 影响 DNA 合成，抑制细胞生长等。培养基：可能无明显表现；显微镜下：慢慢会使细胞状态变差,生长变慢，在显微镜下观察可能会有小黑点，但培养基一般不发生 浑浊。细胞传代以后就出现细胞间黑点，细胞空泡化，很多类似凋亡、坏死的细胞，最终细胞漂浮，完全死亡。细胞生长缓慢，或者出现无明显诱因脱落，凋亡，细胞碎片增多，有的甚至只表现为细胞状态日渐不佳。成像：处理方法：采用支原体清除剂，有同学说用泰乐处理支原体污染效果比较好。用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。一般处理起来比较复杂，因此多放弃细胞重新培养。5、 黑胶虫污染培养基：可能无明显表现，或液体颜色异样显微镜下：大量黑点原地震动，与细菌污染相鉴别，细胞状态不佳。有的因细胞密度较高，或细胞增殖较快，细胞代谢产物增多，要注意鉴别。成像：处理方法：黑胶虫在科研领域还是很未知的啊。所以没有什么好的应对方法。预防为主！还是要强调无菌操作啊！尤其注意血清的质量！这个是主要来源。一般建议用北美血清，这个黑胶虫污染会概率小。6、 原虫污染培养基：培养液可轻微浑浊显微镜下：细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞占优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。成像：处理方法：在操作的过程中，一定要小心操作动作，轻柔缓慢，切忌大动作鲁莽。防止细胞脱落。这个拯救细胞还是主要针对无路可退的时候。污染还是重在预防！细胞房培养箱每两周更换一次水（高压过的双蒸水），条件允许的每两周可以用酒精擦洗一遍培养箱；地面每两到三天用新洁尔灭拖洗一遍