肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义

抗肿瘤药物5 -氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响(细胞刮擦法)实验指导肿瘤组织增殖失控、肿瘤细胞分化异常、肿瘤细胞具有侵袭和转移能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，侵袭和转移也是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。 因此，研究肿瘤浸润和转移的规律和发生机制对恶性肿瘤的防治具有重要意义。肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管和体腔，直至靶组织和靶器官，与原发肿瘤不连续，在组织学上可以形成相同类型的肿瘤。 前者称为原发性肿瘤，后者称为转移性肿瘤或继发性肿瘤。图1肿瘤转移图肿瘤异质性理论表明，许多恶性肿瘤最初起源于单克隆，但在其增殖发展为临床明显肿瘤时，由于肿瘤细胞遗传性状的不稳定性(基因突变或缺失等)而不断变异，该肿瘤内肿瘤细胞亚群表型的多样性如肿瘤细胞侵袭性、生长速度、转移能力、 引起对核型乃至激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些肿瘤细胞亚群就这样具有不同的特性，即所谓的异质性。 异质性与肿瘤转移直接相关的是癌细胞的转移可能性，癌细胞的转移可能性高低，转移可能性高的肌细胞容易转移。肿瘤细胞的运动性来源于细胞运动“接触抑制”的概念。 通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，正常纤维母细胞在迁移过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞表面接触时，常发生细胞膜活动的抑制和迁移中细胞的缩短，随后停止迁移。 成纤维细胞生长过程中融合到培养皿中形成单层，可显着抑制细胞运动。 间变的肉瘤细胞缺乏接触抑制，肿瘤细胞的运动不受正常成纤维细胞的抑制。针对肿瘤转移的复杂过程，开发了血小板聚集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素及其他化学药物等多种抗转移药物。细胞刮擦法是测定肿瘤细胞运动特性的方法之一。 参考体外细胞伤害愈合实验模型，观察体外培养的单层细胞受伤后加药抑制肿瘤细胞迁移的能力。 下图为划痕实验的模式图，图中细胞层出现空痕(a )，给药后，药物作用下细胞的移动受到抑制(b )，未给药的细胞维持原来的移动能力，经过一定时间后通过移动隐蔽划痕(c )。A B公司c.c图2的实验结果(a为单层细胞划伤的b加入抑制剂，显示为阳性对照组的c为未加入抑制剂的阴性对照组)。一、实验目的1 .了解肿瘤细胞转移的基本原理2 .测定细胞运动特性的方法细胞划痕法二、实验原理肿瘤细胞具有体外移动能力，本实验参考体外细胞伤害愈合实验模型，利用细胞伤法测定肿瘤细胞的运动特性。三、仪器和试剂1 )细胞系及其培养：肝肿瘤细胞HepG22) 24孔、吸液管、倒立显微镜3 )主要试剂： PBS、DMEM培养液、0.25%胰酶、胎牛血清、5氟尿嘧啶溶液(1ug/ml )。四、实验步骤1.5氟尿嘧啶溶液的制备用灭菌蒸馏水溶解精密称量10mg，定容在100ml容量瓶中，精密转移1ml溶液，稀释至100ml，得到1ug/ml 5-氟尿嘧啶溶液。2 .单层细胞的制备将细胞密度为510105个/mL的Hep G2细胞铺在24孔(每孔500 uL )中，加入含有10%胎牛血清的RMPI.1640培养液，培养1624 h形成单层细胞。3 .伤口以五氟尿嘧啶(5fu )为例，首先制备1 g/L母液，用PBS将45 L稀释至1.1 mL，得到浓度40 g/ML的5 fu溶液。用10 uL移动枪的枪口(或无菌指甲杨枝)对单层细胞呈“一”字样伤口，用PBS洗涤3次后，加入上调的5fu溶液，2个样品并行孵化24小时后，变成含10%胎牛血清的RMPI.1640培养液，孵化24小时4 .观察并拍照吸取培养液，用PBS洗涤3次后，用倒置荧光显微镜观察，拍照。五、注意事项：1 .实验时要注意细胞的生长情况，选择合适的细胞接种浓度。 对不同细胞观察细胞壁率等，决定实验时细胞的接种数和培养时间，保证培养结束时密度适当。2 .用PBS缓冲液清洗时，注意不要使附着在墙壁上的细胞扩散，以免影响实验的摄影结果。3 .药物筛选过程中对细胞迁移能力的影响也是重要的一方面。 实验设计过程中应选择合适的阳性对照组和阴性对照组。六、思考问题1 .通过实验验证化学物质如何恢复或增强细胞的移动能力2 .如何避免化学物质浓度过高引起的细胞毒性对实验的影响？七、参考文献：1 .司徒镇强，吴军正细胞培养； 兴界图书出版公司2004年3月第1版2.Mary Birch、Stephen Mitchell、andianr.hart.androvitionandcreationandcreationofhummelanamcellvariantsexpressinghighandlowlevelsofcc 51: 6660-66673 .何贤峰、杨述华等.唑来膦酸对骨肉瘤细胞生物学行为的影响.肿瘤防治