菌种鉴定标准操作规程

应变识别的标准操作程序目的：建立菌株鉴定的标准操作程序范围：适用于* * * * * *评估标准操作职责：内容：1总体操作步骤1.1待鉴定细菌的纯化和分离用接种环选择待鉴定的菌落或含少量细菌的溶液到相应的培养基(如TSA)中，划线分离，直至出现单个微生物菌落。1.2选择纯化的单个菌落，进行革兰氏染色和显微镜检查，确定待鉴定细菌的革兰氏属性。1.3如果镜检结果为革兰阴性杆菌，应先进行发酵实验。如果发酵试验结果为阴性，则选择API20NE试剂条进行鉴定。如果发酵试验结果为阳性，细胞色素氧化酶试验后选择API20E试剂条进行鉴定。1.4如果显微镜检查结果显示为革兰氏阳性球菌，应首先进行过氧化氢酶试验。如果检测结果为阴性，则选择美国药典链球菌试剂条进行鉴定；如果检测结果为阳性，选择美国药典链球菌试剂条进行鉴定。1.5如果显微镜检查结果为革兰阳性杆菌且有内生孢子，则选择API 50CHB试剂条进行鉴定。否则，根据运动实验和过氧化氢酶实验的结果，选择原料药棒或其它试剂条进行鉴定。1.6选择正确的试剂条后，按照不同原料药试剂条的标准操作程序制备接种物，进行接种、培养等操作。并将结果形成数字代码。使用原料药识别软件识别或查询待检测细菌的名称。应记录评估结果，必要时应给出相应的解释。革兰氏染色2.1染料的制备2.1.1结晶紫染色溶液：液体甲：结晶紫1.0克95%酒精20毫升液体乙：0.8克草酸铵水80毫升将液体a和液体b混合均匀，静置48小时，储存在密封的棕色瓶中。2.1.2碘溶液：碘1.0克碘化钾2.0g水300毫升制备时，先用3 5ml水溶解碘化钾，然后加入碘，用力摇匀使其完全溶解，加水稀释至300ml，摇匀，储存在棕色瓶中。2.1.3稀释的红色碳酸盐溶液：碱性品红1.0g5.0毫升石炭酸95%乙醇10.0毫升制备时，用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100毫升，摇匀。2.2操作：2.2.1涂片：液体培养物中的菌体被接种环挑出来，涂在载玻片上成薄层，固体培养物先滴一滴蒸馏水或生理盐水，少量菌体被接种环挑出来，涂在载玻片上成薄层。2.2.2干燥和固定：涂层在酒精灯火焰上方自然干燥或轻微加热，并通过火焰2-3次以固定涂层。2.2.3染色：向固定标本中加入几滴结晶紫溶液，使染色液覆盖整个涂片标本。染色1分钟。2.2.4清洗：倾斜载玻片，使含有极细水的纯净水从染色样品的上端流下。不要让水流直接冲洗涂片，直到冲洗水无色。2.2.5加入几滴碘溶液，冲洗掉残留的水和媒染剂染料约1分钟。纯净水用来冲走碘溶液并吸干它。2.2.6滴加95%乙醇脱色约20 30秒。脱色时，应轻微振动载玻片，使酒精均匀分布，并立即用水冲洗。2.2.7用稀碳酸红溶液染色1分钟后，用水洗涤，晾干或吸干。2.2.8显微镜检查：首先用低倍显微镜观察找到合适的位置，然后在涂片上滴一滴香油，用100倍物镜观察细菌的革兰氏特性。革兰氏阳性菌被染成蓝紫色，革兰氏阴性菌被染成红色，并且还进行阳性对照。3简单染色3.1用于真菌和细菌的鉴定。3.2操作：3.2.1涂片：液体培养物中的菌体被接种环挑出来，涂在载玻片上成薄层，固体培养物先滴加一滴蒸馏水或生理盐水，挑出少量菌体3.2.3染色：向固定标本中加入几滴结晶紫溶液，使染色液覆盖整个涂片标本并染色1分钟。3.2.4清洗：倾斜载玻片，让含有极细水的自来水从染色标本的上端流下，不要让水流直接清洗涂片，直到清洗水无色，然后自然干燥或吸干。3.2.5显微镜检查：首先用低倍显微镜观察找到合适的位置，然后在涂片上滴一滴香脂，用100倍物镜观察菌体形态。4 3%氢氧化钾试验4.1材料3%氢氧化钾溶液、无菌木制牙签、待检测细菌的新鲜纯培养物(18-24小时)。4.2操作4.2.1将3滴3%氢氧化钾水溶液等距离滴在干净的载玻片上。4.2.2铜绿假单胞菌或具有同等反应的菌株用作阳性对照。4.2.3使用枯草芽孢杆菌或具有同等反应的菌株作为阴性对照。4.2.4用木质牙签从培养基中选择新鲜的纯培养物(18 24小时)，分别为阳性、阴性和待检测细菌，置于载玻片上的3滴氢氧化钾水溶液中。4.2.5然后用牙签将悬浮液搅拌30 60秒，轻轻向外拉悬浮液。如果是革兰氏阴性菌，悬浮液和牙签之间有粘性线，如果是革兰氏阳性菌，没有粘性线。4.2.6结果的判断如果溶液的粘度增加，并且在4.2.6.1 15秒内形成粘性线，则认为测试菌株对氢氧化钾呈阳性，并且测试菌株为G-。如果4.2.6.2溶液不产生粘丝，则氢氧化钾试验判定试验菌株为阴性，试验菌株为g在4.2.6.3，只有当阳性和阴性结果都是典型反应时，测试才有效。5接触酶试验(过氧化氢酶试验)5.1细菌代谢产生的过氧化氢对细菌细胞有毒副作用，细胞内接触酶可以催化过氧化氢分解为分子氧并解毒。当将过氧化氢溶液滴加到含有接触酶的细菌培养物中时，会产生大量气泡(阳性)。5.1材料3%过氧化氢溶液、无菌木制牙签、干净的载玻片、滴管。5.2操作5.2.1使用无菌木制牙签挑出要检测的新鲜细菌的纯菌苔，并将其放在干净的载玻片上。5.2.2向载玻片上的菌落中加入一滴3%的过氧化氢溶液；或者将3%过氧化氢溶液测试溶液直接滴在琼脂培养物上。5.2.3结果判断：立即观察结果，气泡的产生是一个积极的反应，而气泡的产生是一个消极的反应。以金黄色葡萄球菌或具有同等特性的菌株为阳性对照，以铜绿假单胞菌或具有同等特性的菌株为阴性对照，重复上述步骤。5.2.4注意事项5.2.4.1阴性对照和阳性对照必须是实验有效前的典型反应。当过氧化氢溶液被添加到生长在血液琼脂平板上的菌落中时，5.2.4.2产生假阳性结果(因为红细胞含有过氧化氢酶)。5.2.4.3必须将过氧化氢酶溶液滴到菌落上。操作顺序不能颠倒，否则将产生假阳性结果。5.2.4.4不应该使用铂针或环来混合培养物和过氧化氢酶水溶液，因为铂针会导致假阳性结果。因此，在本实验中，使用木制无菌牙签或塑料无菌接种环。葡萄糖氧化/发酵试验6.1氧化发酵培养基含有浓度较低的蛋白胨和浓度较高的碳水化合物。待检测的细菌通过氧化或葡萄糖发酵产生酸，从而降低其酸碱度。介质中的指示器从绿色变为黄色。6.1材料6.1.1无菌矿物油：液体石蜡用高压蒸汽在121灭菌半小时。6.1.2氧化发酵培养基：葡萄糖10g，胰蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，琼脂4g，溴百里酚蓝0.08g，去离子水1000ml，pH6.6-7.0。分成13100毫米的小试管，在121下灭菌15分钟。垂直放置，固化后使用。6.2操作6.2.1打开小试管。6.2.2用接种针挑取分离的单个纯菌落，将氧化发酵培养基刺入约1cm深，分别接种两个试管。6.2.3向其中一个试管中加入无菌矿物油，并覆盖培养基的表面6.2.4用同样的方法在试管中接种大肠杆菌或等效菌株作为阳性对照，铜绿假单胞菌或类似菌株作为阳性对照。6.3培养：将接种后的发酵培养基放入35 37的培养箱中培养24小时，观察结果。如果结果为阴性，继续培养24小时。6.4结果的判断6.4.1培养基变黄，反应结果标记为阳性。6.4.2培养基仍为均匀绿色，反应结果为阴性。6.4.3如果培养基的颜色从绿色变为蓝色，这是由微生物的产碱反应引起的，并被标记为阴性。7细胞色素氧化酶试验细胞色素氧化酶是一种铁卟啉酶，它氧化还原的细胞色素C并以非活性还原状态存在。由于电子向分子氧的转移，还原的细胞色素氧化酶再次变得活跃。在分子氧的存在下，细胞色素氧化酶和细胞色素C系统可以还原一系列有机物质。其中，它在指示条的反应区还原-萘酚和二甲基对苯二胺，形成靛酚蓝分子，并通过该反应对细菌进行分类和鉴定。7.1材料细胞色素氧化酶检测指示条，指示条反应区的主要成分：二甲基对苯二胺0.1mol，-萘酚1.0mol。7.2操作7.2.1用牙签从培养基中挑出一个生长良好的菌落(菌落的酸碱度不得低于6.0，否则会出现假阴性结果)。7.2.2菌落应均匀涂于反应区，20 60秒后比较反应区的颜色。7.2.3如果反应区由紫色变为深紫色，则为阳性反应，无变色或黄色为阴性反应。基于系统发育分析的8 16S rDNA序列测定和比对8.1当药物无菌试验为阳性或培养基灌装试验为阳性时，有必要在分子水平上鉴别基础污染菌和与污染菌相似的细菌。这些样本被送到测序公司进行测序。9洁净区环境控制-微生物鉴定表环境水平面积识别范围a级空煤气物种鉴定人事部门表面b级空煤气属的鉴定(革兰氏染色)人事部门表面c级空煤气对属的过度标准鉴定，其他革兰氏染色表面其他的革兰氏染色附件：附录1应变识别标准操作程序流程图相关文件和记录：