人类染色体的制备.ppt

人类染色体的制备,人类外周血淋巴细胞染色体标本制备,目的和要求:了解人类外周血淋巴细胞的培养方法。掌握染色体标本的制备方法。,材料:培养人的外周血淋巴细胞。,人类外周血淋巴细胞染色体标本制备,人类外周血淋巴细胞染色体标本制备,实验原理：在健康成年人外周血中，含有红细胞、白细胞和淋巴细胞。红细胞没有细胞核，无法得到染色体，只能通过淋巴细胞得到染色体。在通常情况下，它们都处在间期的G1期或G0期，一般情况下不进行分裂。但在体外适宜培养条件下，它们经有丝分裂原如植物血凝素（PHA）的作用可转化成为淋巴母细胞，而重新进行有丝分裂活动。因此，当该类细胞在人体外经PHA刺激短期培养后，经秋水仙素处理使正在分裂的细胞停止在中期，再经低渗和固定等处理，即可得到较多可供分析的中期染色体标本。,人类外周血淋巴细胞染色体标本制备,试剂:植物血凝素(PHA)刺激外周血淋巴细胞从G0期返回正常细胞周期。秋水仙素（colchicine）作用：阻止微管组装。中期染色体无法排列赤道板。抑制姐妹染色体的分离，将细胞停留在中期。目的:获得大量的中期细胞。,人类外周血淋巴细胞染色体标本制备,其他试剂：低渗液(0.075mol/L氯化钾):能使细胞膨胀，便于染色体分散而易于观察和计数固定液(甲醇与冰醋酸按3:1配制):稳定染色体的形态结构，清除染色体外层物质对染色体在玻片上展开的影响，通过更换固定液2-3次，清除红细胞的碎片，使标本片的背景更为清晰，现用现配。Giemsa染液,人类外周血淋巴细胞染色体标本制备,实验步骤：1.人类外周血淋巴细胞的培养提取血液在含PHA、血清的培养基中培养72小时。大多数细胞进入第二细胞周期。实验前4小时加入秋水仙素。实验时，多数细胞停留在中期。,人类外周血淋巴细胞染色体标本制备,2.染色体标本制备1）摇匀培养物，吸取培养物于离心管中。2）2000r/m离心6min(注意配平),吸弃上清液。,人类外周血淋巴细胞染色体标本制备,3）低渗:加入预温37的6mlKCl(0.075M),吹打混匀沉淀,37水浴15min，以达到红细胞破裂、淋巴细胞膨胀和染色体分散的目的。4）预固定：加入新配置固定液（甲醇：冰醋酸=3:1配制）1ml，混匀,2000r/m离心6min,吸弃上清。,人类外周血淋巴细胞染色体标本制备,5）固定:加入6ml固定液，混匀，室温放置10min。6)2000r/m6min,吸弃上清液。7)再固定:重复5,6步一次。8)加入0.5ml固定液,非常小心混匀沉淀，制成细胞悬液。9）将混合液从30cm左右高度滴2-3滴于冰湿的载玻片上。空气凉干。,人类外周血淋巴细胞染色体标本制备,3.染色滴加数滴Giemsa,染色3-5min.自来水冲洗,空气凉干。,人类外周血淋巴细胞染色体标本制备,1）摇匀培养物，吸取培养物于离心管中。2）2000r/m离心6min,倒去上清液。3）低渗:加入预温37的6mlKCl(0.075M),吹打混匀沉淀,37水浴15min.4）预固定：加入新配置固定液1ml，混匀,2000r/m离心6min,倒去上清。5）固定:加入6ml固定液，混匀，室温放置10min。6）2000r/m6min,倒去上清液。7）再固定:重复5,6步一次。8）加入0.5ml固定液,非常小心混匀沉淀，制成细胞悬液。9）将混合液从3