层析填料的选择及其装柱技术介绍幻灯片PPT课件VIP

-,1,层析填料的选择及装柱技术介绍,佳辰公司生物中心陈阶2012-04-18,-,2,如何选择填料？,一、依据所纯化的对象的各物理和化学特性。（一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等）二、纯化所要达到的目的（粗提？中度纯化？精细纯化？）。三、所要选择的层析方法1.凝胶过滤(Gf)2.离子交换(IEX)3.亲和层析(AC)4.疏水层析(HIC)5.反相层析(RPC)四、填料自身的物理化学特性,-,3,合理衔接不同层析技术,-,4,-,5,凝胶过滤如何选择填料？一、4种主要常用的凝胶类型,葡聚糖凝胶：Sephadex（SephadexG中G值越小，交联度越大，吸水性越小）适合脱盐、buffer交换琼脂糖凝胶Sepharose（宽广的分离范围）聚丙烯酰胺凝胶sephacryl（Bio-Gelp）琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶Superdex（高分辨率、高回收率，运行时间短）,-,6,二凝胶过滤填料的选择原则,1凝胶的交联度越高，孔径越小。2对大分子物质的分离，多采用琼脂糖。3对小分子物质的分离，多采用葡聚糖。4凝胶颗粒的粗细影响分离效果。,-,7,-,8,-,9,-,10,SephadexLH-20为例,SephadexLH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化加工而成，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等。SephadexLH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。PharmadexLH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。,-,11,SephadexLH-20为例,对于SephadexLH-20而言，25100m的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长柱（最高至250cm）而言也是同样的。在装柱前，层析柱和储槽都必须进行彻底的清洗。SephadexLH-20在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。1在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统。2使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%，上层溶剂占25%，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。3将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。（考虑到损耗，称量SephadexLH-20干胶138g（柱体积589.05ml），放入2000ml的烧杯中，加入双蒸水1200ml并在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸10分钟，随后取出，室温静置3小时以上，直到温度降为室温。）,-,12,-,13,离子交换层析如何选择填料？,根据被分离物质分子表面电荷性质进行吸附解吸附。,-,14,-,15,-,16,-,17,-,18,离子交换层析如何选择填料？,-,19,离子交换层析如何选择填料？,-,20,利用被分离的（生命大分子）物质和特异性配体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法。分类：特异性配体亲和层析：配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体、酶的类似物等）。其特点是吸附特异性强，结合力大通用性配体亲和层析：配体一般为简单的小分子物质（如金属、染料、氨基酸等）。其成本低，具有较高的吸附容量，但分辨率不及前者,亲和层析,-,21,亲和层析如何选择填料？（亲和吸附介质：基质+配体）,一、基质的选择理想的基质应符合下面的要求：1极低的非特异性吸附。2高度的亲水性。3较好的理化稳定性。4大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。5适当的多孔性。一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。,-,22,常用亲和吸附剂采用的基质,一般有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻璃珠等。商品纤维素：具有非特异吸附性，且本身结构不均一聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖：与配体结合后，多孔性会大大降低，且聚丙烯酰胺凝胶具有大量酰胺键，不易在载体与配体之间引入间隔物玻璃珠：具有多孔性好，机械性能强等优点，但对有的物质也有一定的吸附力目前使用最广泛的是Sepharose4B，它是有D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖，极易用溴化氰活化，并易于引入不同基团；在温和条件下可连接较多的配体，容易吸附大分子物质，且吸附容量较大,-,23,二、配体的选择理想的配体应具有以下一些性质：1)配体与待分离的物质有适当的亲和力。2)配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性。3)配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落。4)配体自身应具有较好的稳定性。根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specificligand）和通用性配体（generalligand）,亲和层析如何选择填料？（亲和吸附介质：基质+配体）,-,24,亲和吸附介质的配基,（1）酶的抑制剂（2）抗体（3）A蛋白A蛋白（proteinA）为分子量约42KD的蛋白质，存在于黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的细胞壁中，占该细胞壁构成成分约5。A蛋白在确定其为蛋白质之前称A抗原。（4）凝集素凝集素(lectin)是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。（5）辅酶和磷酸酰苷（6）过渡金属离子（7）组氨酸（8）肝素（heparin）,-,25,能用于亲和层析的分子上的基团,-,26,亲和介质反应基团,-,27,CNBr是最常用的偶联剂，偶联过程分为基质的活化、偶联、去除未结合配体、配体结合量的测定等步骤,基体配体吸附剂的制备,-,28,以CNBr活化的琼脂糖凝胶4B为例,CNBr活化Sepharose4B产生的氰酸酯可和蛋白质类配体一氨基共价偶联作用。5.0g溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B粉末溶于100毫升的1mMHCl-静置15-20分钟，使之膨胀-以水流抽气方式经WhatmanNO.5滤纸去除HCl-再以1mMHCl清洗-以总量为100ml的偶联缓冲液（0.1M碳酸氢钠+0.5M氯化钠，PH8.3）分数次清洗-将吸干的溴化氰活化的琼脂糖凝胶自滤纸上刮下，加入含CA-OVA120毫克的偶联缓冲液20毫升-以试管反复颠倒的混匀方式于室温下反应2小时。-以900rpm离心5分钟，以去除偶联缓冲液（收集，测未偶联的CA-OVA的量）-加入20毫升封闭缓冲液（0.2M甘氨酸，PH8.0）-以试管反复颠倒的混匀方式于室温下反应2小时-再以偶联缓冲液清洗一次-以100毫升含0.5NNaCl的0.1M醋酸缓冲液清洗-最后以偶联缓冲液清洗五次，即可装填管柱。,-,29,疏水层析如何选择填料？,疏水层析和反相层析(reversedphasechromatography)分离生命物质的依据是一致的，即:视有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差异性大小，将有效成分分离出来,-,30,疏水层析填料类型,1亲水性填料基质主要是：交联琼脂糖(SepharoseCL-4B)配体是：苯基或辛基化合物基质与配体通过耦合方法构成稳定的苯基(或辛基)-SepharoseCl-4B吸附剂2非亲水性填料基质有：硅胶、树脂(苯乙烯、二乙烯聚合物)等。配体为：苯基、辛基、烷基(C4、C8、C18)等，二者通过共价结合构成非亲水性吸附剂。,-,31,疏水层析填料选择考虑因素,目标蛋白的疏水性（包括纯化策略即：是否是高度纯化）填料基质及配基物理化学特性填料中配基的取代度填料的吸附解吸附条件与目标蛋白的兼容性。,-,32,疏水介质选择,-,33,反相层析如何选择填料,所谓“正相”或“反相”，主要是指固定相和流动相的相对极性大小，反相层析因与传统分配层析刚好相反而得名，其固定相非极性强而流动相极性相对较高，样品中组分被洗脱的顺序是极性较高的组分先流出，极性较低的后被洗脱。反相介质的选择性主要由键合在基质上的配基类型决定。最常用的配基是线性的正烷烃基团（n-烷基），如n-辛基（C-8）、n-十八烷基（C-18），此外也会采用n-丙基、n-丁基、n-丙基苯基、二苯基等疏水基团。,-,34,反相层析介质,由多孔基质颗粒键合疏水性的配基组成，因具较小的颗粒直径，普遍有较高的柱效；反相层析领域使用时间最长，应用最广泛的基质是硅胶缺点：高pH下非常不稳定新开发以合成有机物作为基质的反相介质-如聚苯乙烯-二乙烯苯类，具优良的化学稳定性，强酸强碱下的稳定性弥补了硅胶基质的缺陷。,-,35,反相层析填料常见类型,（一）SOURCETMRPC（聚苯乙烯颗粒）能耐受反相层析中常用的有机溶剂，对6mol/L的盐酸胍、0.1%的SDS等具良好耐受能力各种肽、蛋白质、寡聚核苷酸等分析和制备型分离纯化（二）RPCC2/C18（多孔硅胶微粒为基质）在有机溶剂中稳定性较好，但pH稳定范围较窄，仅能在pH27范围内使用，对变性剂、去污剂等试剂具良好的耐受，操作温度范围440粒径小，适合肽谱分析和极微量纯化过程（三）SephasilProtein/SephasilPeptide（多孔硅胶为基质）理化稳定性和RPCC2/C18介质相似，温度范围470,-,36,反相层析填料的选择原则,考虑样品组分的种类和性质、分离的规模及对分辨率的要求、流动相条件：待分离物分子量，对介质孔径的选择提供指导；样品组分的疏水性质决定采用何种配基；分离的规模及对分辨率的要求也是须考虑的因素，通常分离规模和分辨率的关系是负相关的；反相层析时的流动相条件很大程度上影响反相介质基质的选择。,-,37,SOURCERPC家族:聚合体基架vs传统硅胶基架,-,38,较大的孔径300质量传递有改善用于纯化蛋白，大肽及其DNA,SOURCERPC家族:聚合体基架vs传统硅胶基架,-,39,硅胶-硅烷醇-配基,硅烷醇基团,18烷基团,C2,S,i,O,H,S,i,O,S,i,(,C,H,2,),1,7,C,H,3,C,H,3,C,H,3,C,H,3,S,i,O,S,i,C,H,2,C,H,3,C,H,3,S,S,SOURCERPC家族:聚合体基架vs传统硅胶基架,-,40,我们用的POROSR150,基质：Cross-linkedpoly(styrene-divinylbenzene)表面基团：nativepoly(styrene-divinylbenzene)溶胀系数：1%from1-100%solvent颗粒大小：50um最大流速（最大压力）：2000cm/hr(10MPa)pH范围：114温度范围：580化学耐受性：水，0100%酒精、乙腈等常见溶剂均有很好的耐受性Poros50填料基本不会萎缩也不会膨胀，所以装柱时不需要在液面上留下缓冲空间,-,41,凝胶的保存,凝胶的保存：1经常使用的凝胶以湿态保存为宜。2长期不用的凝胶可采用干燥保存法。,-,42,实验室层析柱装柱技术介绍,好的柱效是层析成功的关键不同种类的凝胶、不同的层析柱有不同的装柱方法柱效测定的方法层析柱的维护,-,43,柱长,1L/D（长度/直径）：比值高的柱子分辨率高；2柱长相同时：直径大分辨率高；直径小分辨率低。3分析时，采用直径较小的柱子；制备时，采用直径较大的柱子。4交联度小的凝胶柱不宜细而长，否则操作上有困难。,-,44,理论塔板数,N/m=5.54(Ve/Vh)2100/L,As=b/a,-,45,检测柱效,检测装柱效果一般用0.5%(30um介质)或1%(90um介质)柱体积的1%丙酮测柱效和峰形Thelinearflowrateshouldbe30cm/hfor34mand50mmediaand20cm/hfor90mmedia,-,46,填料装柱前处理,1除去影响流速的过细颗粒“水力浮洗法”：将颗粒粗细不均的凝胶悬浮在大体积的水中，让它自然沉降，过细的颗粒浮在上面，倒去即可。反复几次。2溶胀使用前需直接在欲使用的洗脱液中浸泡溶胀。通常使用“热法”溶胀，即在沸水浴中，将悬浮于洗脱液中的凝胶浆逐渐升温到近沸，12小时即可。,-,47,计算柱子的上样体积,1.分析工作时，样品体积为柱床体积的14%；制备分离时，样品体积为柱床体积的2530%。2.分离体积（Vsep=Ve1-Ve2）当样品体积Vsep时，两个相邻组分不能完全分离。,-,48,装柱一般步骤,1装柱：先在柱中加入约1/3高度的洗脱液，边搅拌边加入凝胶悬浮液。2平衡3检查柱子是否均匀,-,49,流速的换算,线性流速对体积不同的柱子来说，体积流速不能直接用作比较，一般都换算成线性流速，再作比较：体积流速(ml/min)x60线性流速(cm/hr)=柱子横切面积(cm2),-,50,操作压力,1洗脱时维持流速的恒定。2用恒流泵维持恒压，从而维持恒流。3.装柱时，为了压实柱床，应该逐步阶梯型提升压力（注意不能超出填料或柱子的最大压力）,-,51,装柱需要注意的几点,选择一根设计良好的柱子仔细混合均匀凝胶浆在生产时使用柱子的温度下装柱用平缓的动作将凝胶浆一次性加入柱子中用恒压或恒流装柱稳定和平衡凝胶柱床检查柱效，必要时重装,-,52,装柱后,Itisimportantthatthecolumnisproperlyequilibratedbeforethepackingisevaluated(2columnvolumes).Itispreferabletorunthreetestrunstoseewhetherthetestvaluesarestable.Ifapoorresultimprovesduringthistest,thereasoncanbethatthecolumnwasnotproperlyequilibrated.Tocheckthatthebedisstable,runthecolumnat70%packingpressurefor20hoursandtestitagain(preferablythreetestruns).Notethatpressurespikesmaycausepoorpacking(cracking).Ifthishappens,anairtrapandapressurereliefvalvear