发酵液预处理PPT课件VIP

-,1,2.发酵液预处理,-,2,2.1概述,为什么要进行预处理？一、发酵液多为黏度大的悬浮液；二、目标产物在发酵液中的浓度通常较低；三、发酵液的成分复杂，大量的菌丝体、菌种代谢物和剩余培养基会对提取造成很大的影响。所以，对发酵液进行适当的预处理，从而分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒(如细胞碎片、核酸及蛋白质的沉淀物)，并除去部分可溶性杂质和改变发酵液的过滤性能，是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤。,-,3,生物分离的流程与单元操作,-,4,2.2预处理简述,发酵液的预处理过程一般包括以下几部分：发酵液杂质的去除，包括除去蛋白质、无机离子以及色素、热原、毒性物质等有机物质；改善培养液的处理性能，主要通过降低发酵液的黏度、调节适宜的pH值和温度、絮凝与凝聚等操作来实现。预处理在生物技术产品的加工和提纯过程中相当重要。,-,5,2.3发酵液杂质的去除,在预处理时，应尽量除去高价无机离子、杂蛋白等。2.3.1无机离子的去除（1）钙离子的去除在发酵液中加入草酸。作用：1除去钙离子；2去除部分镁离子;3同时草酸可酸化发酵液，使发酵液的胶体状态改变，有助于目标产物转入液相。由于草酸的溶解度较小，用量大时可用其可溶性盐(如草酸钠)。4反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液质量。缺点：草酸的价格较高，如果回收利用可以降低成本。例如：在四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，60下反应生成草酸铅，草酸铅在9095下用硫酸分解，再经过滤、冷却、结晶操作后即可回收草酸。,-,6,(2)镁离子的去除可加入三聚磷酸钠，与镁离子形成可溶性络合物，即可消除其对离子交换树脂的影响：用磷酸盐处理，也能大大降低发酵液中钙离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提纯中。(3)铁离子的去除一般用黄血盐与铁离子形成普鲁士蓝沉淀,-,7,2.3.2可溶性蛋白质的去除,（1）盐析法：影响因子有无机盐的种类、浓度、温度和pH值。对于亲水性很强的蛋白质，盐析沉淀法应用更为广泛。（2）等电点沉淀法：当蛋白质所带的净电荷恰好为零时的pH值就称为蛋白质的等电点，此时蛋白质迅速结合成聚集体，极易沉淀析出。在抗生素的生产过程中，一般将发酵液的pH值调至23的偏酸性范围或89的偏碱性范围内，使蛋白质变性沉淀。等电点沉淀一般在低离子强度和pH值约为等电点的条件下进行，多通过加入无机酸(如盐酸、磷酸和硫酸等)调节pH值完成等电点沉淀。优点：省去了后续的脱盐操作，并且当沉淀操作的pH值较低时，杂蛋白更容易变性，所以该方法仍是蛋白质初级分离的有效手段。局限性：由于极端pH值会导致某些目标产物失活，且需消耗大量的酸碱。,-,8,(3)加热法热敏性是蛋白质的一个显著特性。对一些目标产品而言，如果其本身的耐热能力超过了加热处理发酵液时的温度，就可以采用加热的方法除去可溶性杂蛋白。如：在柠檬酸的生产过程中，将发酵液加热到80可以使蛋白质变性凝固，降低发酵液的黏度，在除去杂蛋白的同时，过滤速率也得到了提高。该方法操作简单，成本低。但是当目标产物为热敏性物质时，应该谨慎使用。,-,9,(4)有机溶剂沉淀法原理：有机溶剂使蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，即破坏蛋白质胶体的水膜，同时也可以降低溶液的介电常数，导致蛋白质分子间的静电引力增大，产生凝聚和沉淀。在低离子强度和等电点附近，较易生成沉淀，所需的有机溶剂用量较少。并且随着蛋白质分子量的增大，有机溶剂沉淀更容易进行，有机溶剂的加入量也越少。优点：产生的沉淀物易于分离。缺点：容易引起目标蛋白变性，成本较高，该方法一般只适用于液体处理量较少的情况。常用有机溶剂为丙酮和乙醇。,-,10,(5)吸附法杂蛋白可以被某些吸附剂或沉淀剂吸附除去。例如，利用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾胶状沉淀来吸附蛋白质，这种方法在四环素类抗生素的生产过程中已经取得了很好的效果。吸附法的另一个典型实例是在枯草芽孢杆菌发酵液中，加入可以生成庞大凝胶的氯化钙和磷酸氢二钠，凝胶将蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中一同除去，还可加快过滤速率。,-,11,(6)其他沉淀法聚电解质、某些多价金属离子和非离子型聚合物(如聚乙二醇)也可作为蛋白质的沉淀剂。聚电解质在蛋白质之间架桥，从而生成沉淀。羧甲基纤维素、卡拉胶、海藻酸盐、果胶酸盐和酸性多糖等。,-,12,在碱性溶液中，阳离子如Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ag+、Cu2+、Fe3+、Pb2+等可与蛋白质分子上的某些基团相互作用形成沉淀酸性溶液中三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等物质中的阴离子也可使蛋白质沉淀出来。,-,13,2.3.3有色物质的去除,吸附法，如活性炭吸附、树脂吸附：脱色树脂大网格树脂离子交换树脂预处理工艺还可以添加工业酶制剂：淀粉酶、果胶酶等。,-,14,核酸：沉淀法：加入Mg2或硫酸链霉素,-,15,2.4发酵液处理性能的改善,2.4.1降低发酵液的黏度常用方法有加热法和加水稀释法升高发酵液的温度可以有效降低液体黏度，蛋白质也会凝聚，形成大颗粒的凝聚物，发酵液的过滤特性得到了进一步的改善。加热时必须严格控制加热温度和加热时间：防止活性物变性、细胞自溶。,-,16,2.4.2调节pH值,通过调节pH值可以改善其过滤特性。氨基酸和蛋白质等两性物质在等电点可形成沉淀除去。膜过滤时，调节pH值可改变易吸附分子的电荷性质，减少膜的堵塞和污染在合适的pH值下，细胞和细胞碎片及某些胶体物质会趋于絮凝状态，形成较大的颗粒，有利于过滤操作的进行。还可采用絮凝操作改善发酵液的处理性能。,-,17,25絮凝技术,细胞分离的方法主要有离心和过滤。采用细胞絮凝技术，可简单有效地实现固液分离。2.5.1絮凝和凝聚的区别絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。凝聚是指在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。,-,18,2.5.2细胞絮凝的种类,细胞絮凝方法按是否添加絮凝剂分为两类：自身絮凝，即采用物理手段，如保温或调节pH值，使细胞自身絮凝；絮凝剂絮凝，即添加絮凝剂使细胞絮凝沉降。细胞自身絮凝，从本质上讲是由细胞分泌在表面的絮凝物质造成的，即由微生物絮凝剂产生絮凝。微生物絮凝剂，是指一类由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质，一般为糖蛋白、黏多糖、纤维素和核酸等高分子物质。,-,19,酵母细胞产生絮凝现象的原因：链形成凝聚，不断地进行细胞繁殖之后形成细胞链；交配凝聚，由不同交配型细胞交换交配信息之后，通过细胞表面特殊的蛋白与蛋白连接引起细胞凝聚；无性絮凝，由细胞表面蛋白和酵母细胞外壁的甘露聚糖结合所引起的细胞凝聚，即真正的絮凝。酵母絮凝的糖抑制。,-,20,2.5.3絮凝剂的分类,2.5.3.1常见的絮凝剂絮凝剂从化学结构看，主要分为三类：高聚物、无机盐、有机溶剂及表面活性剂絮凝剂又可分为非离子型、阴离子型(含羧基)和阳离子型(含胺基)三类目前最常见的高聚物絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺类衍生物、壳聚糖絮凝剂、聚苯乙烯类衍生物等由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少(一般为10-6gL)，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝快以及种类多等优点，因而使用范围广，目前主要用于杂质为蛋白质或菌丝体的发酵液。它的主要缺点是存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，应谨慎使用。近年来还发展了聚丙烯酸类阴离子絮凝剂，因无毒，可用于食品和医药工业中。,-,21,絮凝剂的种类及应用,-,22,影响微生物絮凝剂絮凝效果的主要因素有温度、pH值、金属离子等。温度过高或过低对絮凝剂活性都有影响。壳聚糖由于分子中含有大量的氨基，所以它对蛋白质和其他胶体物质具有很强的絮凝作用，可作为阳离子絮凝剂使用。海藻酸钠、明胶、骨胶等天然物质也有絮凝作用。,-,23,2.5.3.2新型絮凝剂,（1）主絮凝剂助絮凝剂（2）新型絮凝剂（3）无机-有机复合絮凝剂（4）微生物絮凝剂与传统絮凝剂复合,-,24,2.5.4絮凝机理,(1)胶体理论絮凝是由于细胞表面的极性基团引起的表面吸附，而使表面自由能降低的过程。(2)高聚物架桥理论细胞的絮凝是由于胞外高聚物纤丝之间架桥交联形成的。(3)双电层理论细胞表面的离子键和氢键参与了细胞的絮凝过程。,-,25,2.5.5絮凝的优化,选择使用何种絮凝剂要综合考虑成本、可行性、毒性等多方面因素。此外，絮凝效果与絮凝剂的加入量、分子量和类型，溶液的pH、搅拌速率和时间等因素有关。加入助凝剂可以增加絮凝效果。剪切力及处理时间(添加絮凝与进一步分离之间的间隔时间)也是很重要的优化参数。,-,26,絮凝的优化流程为：准备好所需的絮凝剂及化学试剂；分别向烧杯中倒入5001000mL的悬浮液试样；搅拌(桨叶速率可为200rmin)；通过加酸或加碱调节每个试样的pH值(例如，如果有6个试样，则分别使其pH值为4、5、6、7、8和9)；同时向各烧杯中加入助凝剂，并开始计时；继续保持高搅拌速率5min；加入絮凝溶液，于1min内混合均匀；降低搅拌速率(例如降至50rmin)保持15min；分析絮凝结果(可通过静置或过滤等方法),-,27,2.5.6絮凝设备,絮凝设备包括絮凝器及絮凝颗粒分离设备，絮凝器主要有以下几种：(1)桨叶式絮凝器(2)折流式絮凝器(3)其他絮凝器,-,28,2