2015年分子生物学实验技能

分子生物学实验技能,邢晓为副研究员中南大学湘雅三医院医学实验中心,研究生课程,内容提要,分子生物学的基本概念及其应用基本的生物信息分析技术分子生物学实验的基本技能,一、分子生物学基本概念,定义：在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等，阐明各种生命现象本质的科学。,分子生物主要研究内容,核酸的分子生物学蛋白质的分子生物学细胞信号转导的分子生物学,1.核酸的分子生物学,核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（moleculargenetics）是其主要组成部分。由于从上世纪50年代以来的迅速发展，该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。中心法则（centraldogma）是其理论体系的核心。,中心法则,DNA,RNA,蛋白质,DNA（Deoxyribonucleicacid）:脱氧核糖核酸,是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料,DNA,DNA双螺旋结构,1953年沃森和克里克提出了DNA的双螺旋结构,开创了分子生物学的新纪元。并在此基础上提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动,A-TG-C,gDNA（基因组DNA）plasmidDNA（质粒DNA）mtDNA（线粒体DNA）ssDNA(鲑鱼精DNA)cDNA(互补DNA)rDNA(核糖体DNA,rDNA就是可以转录产生rRNA的基因)T-DNA(也叫三螺旋DNA，是指一种由三股ssDNA旋转螺旋行成的一种特殊结构,TDNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素),常见的DNA符号,RNA,RNA(RiboNucleicAcid)：核糖核酸，是由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名,简称RNA。RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。RNA一般是单链线形分子;也有双链的如呼肠孤病毒RNA；环状单链的如类病毒RNA；1983年还发现了有支链的RNA分子。,RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤，G鸟嘌呤，C胞嘧啶，U尿嘧啶。其中，U（尿嘧啶）取代了DNA中的T（胸腺嘧啶）而成为RNA的特征碱基。在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类:tRNA（转运RNA）rRNA（核糖体RNA）mRNA（信使RNA）mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。,常见的RNA符号,mRNA信使RNAtRNA转运RNArRNA核糖体RNAcRNA(互补RNA,可用分子作杂交探针)hnRNA(基因转录初产物,在细胞核内不稳定)RNAi,shRNAmiRNA(真核生物内源性的小分子单链RNA，通常18-25nt长，能够与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解),基因,基因：是位于染色体上的遗传功能单位，是编码蛋白质（酶）或RNA的一段双链DNA片段。基因座（locus/loci）：每一对基因分别位于来自双亲的染色体的同一位置上，这个位置称为。等位基因：一对同源染色体同一基因座上的一对基因称为一对等位基因（allele）。复等位基因：在一个群体中，每一个基因座位上可以有2个以上等位基因，这就是复等位基因（multipleallele）。假基因（pseudogene）：与功能基因相似的序列，但由于突变等原因，不能转录或能转录但不能剪接形成成熟mRNA分子。这些序列称为。超基因（supergene）:是指作用于一种性状或作用于一系列相关性状的几个紧密连锁的基因。,基因外显子、内含子,基因一般结构,5,3,ATG,TAATGATAG,外显子：出现在成熟mRNA分子中的基因序列。内含子：不出现在成熟mRNA分子中的基因序列。,2.蛋白质的分子生物学,蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子蛋白质的结构与功能。蛋白质是一种复杂的有机化合物,是由氨基酸分子呈线性排列所形成，相邻氨基酸残基的羧基和氨基通过肽键连接在一起。蛋白质的氨基酸序列是由对应基因所编码。,3.细胞信号转导的分子生物学,细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。,分子生物学的临床应用,亲子鉴定,基因诊断,产前诊断,图1应用AC，AB引物PCR扩增地贫风险胎儿结果1、2为正常人;3患儿父亲;4患儿;5患儿母亲;6胎儿脐带血标本;MMarker,胚胎移植前遗传学诊断（PGD）,从发育到4-8细胞的胚胎中，取出一个细胞进行细胞遗传学或分子遗传学检查，再将检查正常的胚胎放到子宫中，以达到优生优育的目的。,二、基本的生物信息分析技术,生物信息学（Bioinformatics）是一门数学、统计、计算机与生物医学交叉结合的新兴学科,它已广泛地渗透到医学的各个研究领域中，成为生物医学发展不可缺少的重要工具。随着人类基因组计划的快速发展，生物信息学技术在人类疾病与功能基因的发现与识别、基因与蛋白质的表达与功能研究方面都发挥着关键的作用。生物信息学技术在基于基因与蛋白质功能缺陷的合理化药物设计方面也有着巨大的潜力。,生物信息分析常用网站,(基因查找、BLAST比较、domain分析等)/proteomics（蛋白的分子量、等电点、同源分析、结构分析等）http:/rna.lundberg.gu.se/cutter2/（分析酶切位点）/（CpGIslandSearcher）,NCBI中基因序列查找,常见物种名称,Homosapiens(人类)Susscrofa(猪)Rattusnorvegicus(大鼠)Musmusculus(小鼠)Bostaurus(牛)Drosophilamelanogaster(果蝇)Caenorhabditiselegans(线虫)Xenopustropicalis(青蛙)Fugurubripes(真菌),基因阅读框的识别,基因组DNA序列的获得,内含子与外显子的确定,TheboundaryofTSARG4geneexonsandintrons,三、分子生物学基本技术,PCR检测DNART-PCR检测mRNANorthernblot检测mRNASouthernblot检测DNAWesternblot检测蛋白质组织原位杂交检测mRNAIP检测蛋白质之间的相互作用Pull-down检测蛋白质之间的相互作用酵母双杂交检测蛋白质之间的相互作用,1.课题设计与实验方法的选择,检测的目的：检测突变、基因多态性、基因的表达、基因定位、基因表达调控、蛋白相互作用等方法的选择：先了解目前检测都有哪些方法，根据实验目的、实验时间、经费选择合适的方法。,2.实验取材与保存：,实验材料：组织、血液/体液、细胞、病毒等。取材注意事项:(1)取材时动作要迅速，材料尽可能新鲜；(2)注意无菌操作；(3)尽快放入液氮或保存液中；(4)取病理材料时，应加对照等。实验材料的保存：(1)DNA；(2)RNA；(3)蛋白；(4)组织等。,3.实验基本技能,移液器（加样枪）的使用DNA/RNA的抽提PCR/RT-PCR技术Westernblot技术分子杂交技术,（1）移液器的使用和注意,温度密闭性轴芯移动速度试剂的蒸汽,锁定调节,数据读框,枪头与tips紧密结合,3.DNA抽提,DNA主要在细胞核内，核外也有少量称为核外基因的线粒体DNA等。真核细胞基因组DNA提取的主要步骤包括裂解和纯化两大步骤。（1）裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程；（2）纯化则是去除体系中的其它成分，如蛋白质、多糖、脂类及其它不需要的核酸（RNA）等生物大分子的过程。,主要步骤,1.如果材料为组织块，可将组织块（约2001000mg）剪碎后，置入液氮中。随后用冰冷的组织捣碎器捣碎，每100mg组织加入1.2ml消化液（100mmol/LNaCl,10mmol/LTris-HCl，pH8.0，25mmol/LEDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）。2.如果材料是悬浮细胞，收集细胞于微量离心管中，500g5min离心；如果材料是贴壁细胞，弃上清后，胰酶消化收集细胞，500g5min离心。随后用冰冷的PBS缓冲液洗涤细胞，500g5min离心，弃上清，重复一次，并用一倍体积的消化液重悬细胞。3.组织或细胞混悬液移入带盖的离心管中，37消化1218h。4.冷却至4，加等体积15mo1LTES饱和酚。5.轻轻振摇，使水相和酚层充分混匀。6.45000rpm8000rpm离心15min20min。此时DNA溶液在上层，酚位于下层，中间是变性蛋白层。7.用吸管小心吸取上层粘稠溶液，移至另一离心管。注意尽量不要带出中间蛋白层。8.DNA溶液再加等体积15mo1LTES饱和酚抽提一次，按6、7离心并吸至另一离心管。9.加等体积氯仿/异戊醇按步骤（5、6）抽提，离心5min。10.吸出DNA溶液后，再步骤（9）抽提一次。11.用吸管将DNA溶液移至Eppendorf中，冰浴至0。12.加2.5倍体积95%冷乙醇震摇，可见DNA白色沉淀析出。13.用75%冷乙醇清洗34次。14.室温干燥或冷冻干燥DNA。15.加适量TE溶液溶解DNA。,4.RNA抽提,1.取510mg组织放入研钵中，加入适量液氮，研磨。注意研磨过程中不断的加入液氮；2.将上述组织全部移入1.5mLEP管中，加入300L细胞裂解液，用tip打匀，置冰上；3.加入100LProtein-DNA沉淀液，轻轻上下倒置10次，插入冰中35min；4.13000r/min离心3min；5.将上清液移取到另一干净的1.5mLEP管中，13000r/min离心3min;6.将上清液移取到另一干净的1.5mLEP管中，加入300L异丙醇，轻轻上下颠倒50次，混匀样品，可见RNA白色絮状沉淀；7.13000r/min离心1min，弃上清，将EP管倒置在吸水纸上5s，吸干余液；8.加入300L70%的乙醇，轻轻上下颠倒20次，充分洗涤RNA沉淀；9.13000r/min离心1min，弃上清，将EP管倒置在吸水纸上，空气干燥510min，加入50LRNA水合液冰上溶解RNA30min,-70保存。,RNA的电泳检测图谱,灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶污染，使用前必须于180干烤小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37放置小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972）。在15lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸气灭菌15分钟。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。,RNA实验前玻璃制品、塑料制品的处理,用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。,电泳槽的处理,溶液的处理,用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1DEPC于37至少处理12小时，然后于100加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Tris一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。,RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主有涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。,研究人员造成的污染,6.将上清液移取到另一干净的1.5mLEP管中，加入300L异丙醇，轻轻上下颠倒50次，混匀样品，可见RNA白色絮状沉淀；7.13000rpm离心1min，弃上清，将EP管倒置在吸水纸上5s，吸干余液；8.加入300L70%的乙醇，轻轻上下颠倒20次，充分洗涤RNA沉淀；9.13000rpm离心1min，弃上清，将EP管倒置在吸水纸上，空气干燥510min，加入50LRNA水合液冰上溶解RNA30min,-80保存。,Gentra试剂盒抽提法,RNA的质量控制,检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。当R1.82时，说明RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。,RNA的电泳检测一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的。但如果仅仅是为了检测RNA的质量，没有必要进行如此麻烦的实验，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNAsmear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好。,RNA的质量控制,RNA酶活性的控制,为了获得高质量的真核细胞mRNA，必须使用RNA酶抑制剂或采用破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性。同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法：用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。RNA酶可耐受多种处理等，因此可联用上述试剂，从组织中，如富含RNA酶的胰腺中，提取完整无损的RNA。,RNA抽提常见问题与解决方案,PCR技术：聚合酶链式反应（PolymeaseChainReaction，PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。技术原理：双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。,5.PCR技术,PCRMETHODDENATURATIONSTAGE,Hightemperatureseparatesthetwostrands.,PCRMETHODANNEALINGSTAGE,Primerlengthisusually20nucleotides.,PCRMETHODEXTENSIONSTAGE,ThermostablepolymeraseaddsdNTPsoneatatimeatthisstage.,PCRMETHOD-CYCLING,Theaveragenumberofcycles=30forefficiencyreasons.230=1.07X109copies,DNACycle123456Products2481632,Afterthefirsttwocycles,fragmentswiththecorrectlengthbegintobeamplified.(dictatedbytheplacementoftheprimers),平台期与平台效应,平台效应:指经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA片段不再呈指数增长，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。平台效应与下列因素有关：引物、dNTP浓度降低，掺入速度减慢酶与模板的比例下降：酶量减少，模板增加产物的再结合,PCR反应曲线,PCR扩增中的基本成份,H2O：一般采用双蒸水；PCR反应缓冲液；Mg2+Taq酶或其他聚合酶；底物（dNTP:dATP,dTTP,dGTP,dCTP）引物模板,PCR反应体系与反应条件,dH2O6.1L10PCR反应缓冲液1L25mMMg2+0.8LTaq酶或其他聚合酶0.2L2.5mMdNTP1L引物0.2L模板0.7L,10L,95230,9440,58-6440,9540,725,4hold,35cycles,Eppendorf-梯度PCR仪,ABI-9700PCR仪,最大样本数：可扩增96个0.2mlPCR反应管或77个0.5ml反应管。温度范围：4-99加热速度：3/秒。冷却速度：2/秒。温度准确性：0.2。特点：循环时可对变性、退火和延伸同时设温度梯度。,性能,PCR反应体系的优化,1.TaqDNA聚合酶的浓度：1-5U/100l酶浓度过高可引起非特异性扩增；浓度过低则合成产物量减少2.dNTP的浓度：20-200mol/L注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离Mg2+浓度降低,3.Mg2+的浓度：0.5-2.5mmol/L在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。4.模板的浓度及质量：100-200ng/100l模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。5.引物的浓度：0.1-0.5mol/L引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。,PCR反应体系的优化,（1）引物长度及碱基分布：引物长度一般为15-30bp，常用为20bp左右。ATCG最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。（2）G+C含量：以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。（3）引物自身及引物之间：避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，影响引物与模板的复性结合。（4）严格要求配对:特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。,引物设计应遵循以下原则：,引物设计常用的软件,Primer3Primer5PCRdesign,此外，DGGE，甲基化PCR，RNAi引物需要在专业网站中用特殊的软件设计。,Primer3pickprimersfromaDNAsequence,Pastesourcesequencebelow(5-3,stringofACGTNacgtn-otherletterstreatedasN-numbersandblanksignored).FASTAformatok.PleaseN-outundesirablesequence(vector,ALUs,LINEs,etc.)oruseaMisprimingLibrary(repeatlibrary):,Pickleftprimeroruseleftprimerbelow.,Pickhybridizationprobe(internaloligo)oruseoligobelow.,Pickrightprimeroruserightprimerbelow(5-3onoppositestrand).,PCR产物的检测方法,琼脂糖凝胶电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳法；直接测序；分子杂交；限制性内切酶酶切分析；,琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶0.160kb1kb,常见的PCR方法,PCR-SSCP突变检测常用的方法巢式PCR热启动PCR多重PCRPCR-RFLP长PCR原位PCR,RT-PCR为反转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）,由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下cDNA。,6.RT-PCR,RT-PCR技术,优点：1.基因的组织表达谱；2.灵敏性高3.操作简单缺点：1.不能反映基因的原位表达情况；2.不能反映基因的真实大小；3.不能反映基因有几个转录本；4.有时会出现假阳性。,一步法RT-PCR,在20L的反应总体积中加入下列物质：不含核酸酶的水14.4AMV/Tfl5反应缓冲液2dNTP混和物0.425mmol/LMgSO40.8AMV逆转录酶0.4TflDNA聚合酶0.420mmol/L的基因特异性引物各0.4总RNA0.820L,4845min942min9430s57591min683min40cycles687min4hold,二步法RT-PCR,两步法：1）cDNA第一链的合成：在0.5mLEP管中加入无核酸酶的水10L，OligodT引物1L，RNA模版1L,混匀，70水浴，5min。取出后迅速放入冰中，冷却5min。离心5s取出，在冰上加入10PCR反应缓冲液4L，RNA抑制酶1L,dNTP2L，混匀，37水浴孵育，5min。取出后迅速加入逆转录酶1L，混匀，置9600型PCR仪中，42，1h，70，10min，完成后，置4保温。,2）PCR扩增以cDNA模板进行PCR扩增可以以cDNA模板，目的基因和内参基因竞争性PCR扩增来进行半定量检测。,二步法RT-PCR,7.Wes