生物实验技术：第八章光学显微镜及其附属用具

第八章光学显微镜及其附属用具第一节显微镜各部分的构造和用途第二节显微镜的性能指示第三节显微镜的照明操作第四节相差显微镜第五节暗视野显微镜第六节荧光显微镜第七节偏光显微镜第八节微分干涉显微镜第九节倒置显微镜第十节激光扫描共聚焦显微镜（一般了解）第十一节扫描探针显微镜（一般了解）第十二节显微镜的几种附属用具（一般了解）,结构、原理与使用注意事项。,第一节显微镜各部分的构造和用途,光学显微镜,非光学显微镜,复式,第八章,光学系统,显微镜结构：,机械系统,第一节显微镜各部分的构造和用途,第八章,一、光学系统,1.物镜：将被检物体第一次放大。决定了显微镜性能的高低，显微镜的分辨率取决于物镜的镜口率。,显微镜成像原理：,各种像差的存在影响了显微镜成像的质量,第一节显微镜各部分的构造和用途,第八章,像差,像散,球差,慧差,场曲,负畸变,正畸变,色差,第八章,发生在多色光作光源的情况下。,矫正,（Chromaticaberration),第八章,矫正前,矫正后,（Sphericalaberration）,镜头的球形结构使光在边缘的折射角大，中间部位折射角小,图像中间亮边缘模糊,第八章,第一节显微镜各部分的构造和用途,视野中心和边缘不同时聚焦,第八章,物镜的分类：,据使用条件,据放大倍数,10,20,40-45,90-100,据像差矫正程度,第八章,Apo,40/0.65160/0.17,Ach,PL.Apo,镜筒长,盖片厚度,镜口率,放大倍数,第八章,物镜的符号,第一节显微镜各部分的构造和用途,FL,ph,相差,校正物镜,第八章,无盖片物镜,第八章,显微镜对载玻片和盖玻片厚度的要求,标准载玻片:1.10.04mm盖玻片:0.17mm,第八章,第一节显微镜各部分的构造和用途,2.目镜,显微镜成像原理,作用：将被检物体进行第二次放大；矫正物镜成像中的像差等,接目透镜,视场光阑,会聚透镜,第八章,第一节显微镜各部分的构造和用途,目微尺指针,目镜的视场：,第八章,第一节显微镜各部分的构造和用途,2.目镜,3.照明装置,聚光器,反光镜,聚光镜可变光阑滤色镜环,聚光器的镜口率,调节聚光器的镜口率,明视野、暗视野、特殊聚光器（如偏振光、相位差等）,聚光器：主要作用是提高视野亮度和提高物镜对标本的分辨率。,第八章,聚光器的焦点：,聚光镜,可变光阑,0.1mm,1.25mm,载物台,载玻片,1.10.04mm,显微镜观察时，聚光器的镜口率应等于或接近物镜的镜口率,第八章,第一节显微镜各部分的构造和用途,二、机械系统,概念：机械镜筒长（160或170mm):目镜筒的上缘到物镜螺旋口的下端工作距离调焦,第八章,第一节显微镜各部分的构造和用途,瞳距调节,刻度指示,第八章,第一节显微镜各部分的构造和用途,屈光度调节,屈光度调节指示,第八章,第一节显微镜各部分的构造和用途,第二节显微镜的性能指示,主要性能指标：分辨率,其次：放大倍数、清晰度、焦点深度、视场、镜像亮度,分辨率（力）：,第八章,把两点或两线分辨开的最小距离。,=550nmNA=1.25,=400nm,物镜数值孔径NA=nSin,第八章,第二节显微镜的性能指示,=镜口角,（镜口率）,镜口角：,物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜边缘所张的角度。,第八章,第二节显微镜的性能指示,物镜数值孔径大，分辨率高,影响显微镜分辨力的因素？,1.照明光的波长2.物镜镜口率（介质折射率、镜口角）3.聚光器的镜口率（聚光器的高低、光阑开启的大小）,2.放大率（放大倍数）,标准光学镜筒长：物镜后焦点与目镜前焦点之间的距离。,在标准光学镜筒长时，总放大倍数=物镜倍数目镜倍数,显微摄影时：照相倍数=物镜倍数摄影目镜倍数,放大倍数是指长度而不是面积和体积。,有效放大倍数：,物镜镜口率的5001000倍。,第八章,第二节显微镜的性能指示,3.焦点深度（焦深）,焦深与显微镜总放大倍数成反比,2.分辨率和焦深对物镜NA的要求不同,3.显微摄影时，为了增大T值，要牺牲部分分辨率，聚光器NA调至物镜NA的60%-80%,第八章,第二节显微镜的性能指示,4.使用折射率高的封藏剂,调焦后能看清标本在焦点上下的厚度,4.清晰度：,被观察的标本成像明显清晰的能力,主要与物镜性能有关：物镜的色差和球差影响清晰度放大倍数显微镜的合轴调节载玻片、盖玻片厚度使用复消色差物镜显微摄影时，要配合补偿目镜。,第八章,第二节显微镜的性能指示,5.镜像亮度：,与物镜镜口率平方成正比,与放大倍数成反比,总放大倍数相同情况下，使用高倍物镜与低倍目镜的组合,第八章,第二节显微镜的性能指示,显微镜的图像亮度，在显微镜下观察到的图像的明暗程度。,6.视场（视野）：,能观察到的标本的范围,与总放大倍数成反比,相同倍数目镜，广视野目镜比普通目镜视野大,第八章,第二节显微镜的性能指示,第三节照明操作,一、透射式照明：,中心亮视野照明法,斜照明法,二、落射式照明法：荧光或非透明材料观察,第八章,柯勒照明和临界照明,柯勒照明法特点：（1）光源灯丝在可变光阑平面成像；（2）显微镜灯的可变光阑在标本平面成像临界照明法特点：光源经聚光镜后成像在被检物体上。,临界照明柯勒照明,可变光阑调节,三、聚光器与物镜的配合,显微镜摄影时（高焦深）:NA聚=(0.6-0.8)NA物,显微镜观察时（高分辨率）NA聚=NA物镜,可变光阑开度与图像,可变光阑的运用,可变光阑的运用,四、滤光片的选用,光太强：长时间观察：增加分辨率：增加标本的反差：,五、油镜的使用,据目的和要求选择：,第三节照明操作,第八章,第四节相差(phase-contrast)显微镜,光镜的4种观察方式：(A)明视野观察培养的纤维原细胞(B)相差phase-contrast,(C)微分干涉differential-interference-contrast,(D)暗视野dark-field.,第八章,第四节相差(phase-contrast)显微镜,第八章,振幅变化,相位变化,一、原理,利用光波的特性设计的，光有相差、衍射、干涉现象，即利用衍射、干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差,？,肉眼可辨的振幅差,第四节相差(phase-contrast)显微镜,第八章,当折射率和光程长度的差别很小时，直射光与衍射光的相位差约为照明光波长的，即衍射光比直射光慢。,光程：几何路程与媒质折射率的乘积（厚度x折射率）,标本,直射光,直射光,衍射光,直射光,合成波（图像）,第四节相差(phase-contrast)显微镜,第八章,光程差,将直射光推迟,将衍射光推迟,共轭面：直射光通过,补偿面：衍射光通过,聚光镜环状光阑,物镜相板,二、相差显微镜的构造,相位推迟，振幅改变,（相差环）,相差板,第四节相差(phase-contrast)显微镜,第八章,明反差相差板剖面,暗反差相差板剖面,相差板,转盘聚光器：,第四节相差(phase-contrast)显微镜,第八章,三、相差显微镜的使用,相差物镜与相应的环状光阑配合使用,相差环与相差板合轴调节,无色透明/活体标本；检查、鉴定活体细胞；浅染色标本,凹玻璃光程不一，不能用于相差观察,切片不能太厚(510m)；盖片、载片需符合标准,第四节相差(phase-contrast)显微镜,第八章,使用注意事项：,第五节暗视野显微镜,一、原理,利用胶体粒子对光的反射和散射现象为基础，其光源利用的是被检物体散射的光,特点：分辨率：0.02-0.004m,只能观察到物体存在、运动和外部形态,标本要求高（无灰尘，盖片、载片）,二、结构,暗视野聚光器,2.物镜的镜口率小于0.85,？,物镜与载片间能否加显微镜油？,中央遮光法,第八章,第五节暗视野显微镜,第八章,应用：微小粒子、细菌形态观察、细菌记数，透明标本、细胞器观察，病毒包涵体等,第八章,第六节荧光显微镜,荧光：,荧光现象：,第一次荧光现象：（自发荧光）,第二次荧光现象：（诱发荧光）,荧光显微镜检术：,荧光素的特性,第八章,一、原理：,第六节荧光显微镜,第八章,第六节荧光显微镜,第八章,二、构造,4.注意汞灯的调中,使用注意事项：,1.激发光长时间的照射，会造成荧光衰减或淬灭现象。,使用抗衰减剂选择衰减小的荧光素降低激发光强度,2.油镜使用专用无荧光油。,3.减少杂散光干扰,第六节荧光显微镜,第八章,图示：杂散光干扰,无杂光,有杂光,第六节荧光显微镜,第八章,图示：多重染色标本,第六节荧光显微镜,第八章,第七节偏光显微镜（Polarizingmicroscope）,一、特点,将普通光改变为偏光进行镜检，以鉴别某物质是单折射性（各向同性）或双折射性（各向异性）。,各向同性：光性质不因照射方向而改变，普通气体、液体、非结晶固体等各向异性：光速度、折射率、吸收和振动面、振幅随照射方向而不同，晶体、纤维等,第八章,二、原理:,第七节偏光显微镜（Polarizingmicroscope）,第八章,起偏镜,检偏镜,晶体切片,分解成快慢两束偏光,干涉色,氯化汞结晶,第八章,淀粉,塑料,塑料结晶,偏光显微镜观察矿物晶体的干涉色,尿沉渣中的脂肪圆柱体,第八章,第八节微分干涉显微镜,微分干涉镜检术（differentialinterferencecontrast,DIC),一、原理通过渥拉斯顿棱镜将偏振光分解为相互垂直，强度相等的光束，光束分别在距离极近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别，使图像呈现出立体三维感觉。,第八章,二、结构,第八章,第八节微分干涉显微镜,三、镜检时注意事项：,微分干涉灵敏度高，制片不能有污物和灰尘,2.具有双折射性的物质，不能达到微分干涉镜检效果,3.用倒置显微镜作微分干涉观察时，不能用塑料培养皿,第八章,第八节微分干涉显微镜,DIC下的硅藻,第九节倒置显微镜,物镜与照明系统颠倒；用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC或荧光装置。,采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。,当代显微镜的发展趋势,特点：用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描，非侵入式“光学”切片。最大扫描面积达2cm2cm。能显示细胞样品的立体结构，可从不同角度观察其形态。分辨力可达普通光学显微镜的3倍。可进行定量荧光分析。,第十节激光扫描共聚焦显微镜,Laserscanningconfocalmicroscope,LSCM,果蝇囊胚的肌动蛋白的普通荧光显微镜（A）与激光扫描共聚焦显微镜图像（B）比较,一、工作原理：,照明点,探测点,第十节激光扫描共聚焦显微镜,罗丹明123染色后显示的细胞线粒体的定位,LSCM在生物学上的应用：例如：定量荧光测量定量共聚焦图像分析三维重组分析生物结构动态荧光测定：Ca2+、pH及其它细胞内离子测定（动物发育生物学及胚胎学方面）胞间通讯研究粘附细胞分选：如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞细胞激光显微外科及光陷阱技术（如：线粒体、溶酶体、染色体切割）,第十一节扫描探针显微镜,（Scanningprobemicroscope,SPMs),能从原子间距到100m的范围测量样品的表面特性,AFM,扫描隧道显微镜（STM）（1981年，G.Binning，H.Rohner1986年获诺贝尔奖）原子力显微镜（AFM）扫描力显微镜等十多种,标志着对物质表面在显微量级上成像和分析的一个新技术领域的诞生，10-8m,0.2nm横向分辨率；0.005nm深度分辨率,要求被观察样品必须具有导电性！,原子力显微镜（AFM）：1985年,导电性样品及绝缘性样品皆可,STMimageofDNAmolecule,硅表面,琼脂糖膜表面形貌,目微尺格数每格长度=台微尺格数10m,第十二节显微镜的几种附属用具,一、镜台推进器上的纵横游标尺,二、微调焦用调焦轮上的标尺,三、显微量尺1.台微尺2.目微尺,四、描绘器,