生物实验技术：第五章非切片法的制作

第五章非切片法的制作,第一节整体制片法第二节涂片法*第三节分离法第四节铺片法第五节滴片法*第六节压片法,染色：甲基绿、碘液、1%美兰,第一节整体制片法,二、半永久和永久性制片,一、临时制片,第五章,1.甘油封片法,怕压、易碎标本：,2.甘油胶封片法,避免蒸发或流动：,最适合于柔软易碎材料。,石蜡或漆封边,第一节整体制片法,第五章,3.甘油或甘油胶-树胶双封片法,材料要观察的面朝向大盖片,载玻片,盖玻片的小片朝下封于载片上,第五章,第一节整体制片法,甘油或甘油胶封片,中性树胶封片,4.聚乙烯醇封片法,新鲜和固定的标本,小而透明的标本用木素粉红或酸性品红染色,乳酸和石炭酸等量混合剂配4%、5%、10%,甲壳动物、单殖吸虫、寄生线虫、棘头虫及动物中粘孢子,单殖吸虫,棘头虫,第五章,第一节整体制片法,寄生线虫,鱼体表粘孢子虫,棘头虫,30%Alc40%Alc50%Alc60%Alc70%Alc80%Alc95%Alc100%Alc100%Alc纯酒精/二甲苯2：11：11：2纯二甲苯,（1）原生动物(或小型浮游生物)整体封片法,材料特点：在液体培养基中培养或制备成的悬液,弃培养液,各级酒精脱水、二甲苯透明,封片,弃上清液,第一节整体制片法,第五章,5.树胶封片法,离心机的转速,纽虫,华枝睾吸虫,材料特点：身体扁平如叶片状，固定时易卷缩,用薄荷冰/水合氯醛于7%生理盐水麻醉,(2)吸虫整体封片,第五章,第一节整体制片法,70%Alc,第五章,第一节整体制片法,(3)琼脂定位，薮枝虫(或水螅体、卵胚)整体封片,水螅,材料特点：易收缩、需要定位,薄荷冰麻醉,第一节,薮枝虫,第五章,第一节整体制片法,聚缩虫,第二节涂片法,将一些不需切片的动植物的组织细胞或体液组织（如动物的血液、精液、骨髓等）用机械的方法使其均匀地摊在载片上，再进行固定、染色、观察。,对玻片要求严格,洗液,流水冲至中性,第五章,重铬酸钾20g，蒸馏水40mL，加热溶解，稍冷，加浓硫酸350mL,一、人血液涂片,BloodSmear,2.涂片方法：,1.取血：,第二节涂片法,第五章,注意：滴血后马上涂片推片速度、角度大小与血膜厚薄有关一张载片只能涂1次用来推片的载片边缘只能用1次,（1）Wright染色法:,（2）Giemsa染色法,瑞氏粉含曙红和亚甲蓝,吉氏粉含曙红和天青,对酸碱敏感！天青加热会消失！,第二节涂片法,第五章,3.染色,瑞士粉0.1g，甲醇50mL，充分溶解。,将染色液滴加到血膜上，染13min，再滴加等量蒸流水染28min，蒸馏水冲洗，干燥后封片,吉士粉0.38g，甘油12.5mL，甲醇37.5mL。甲醇和甘油60，配制成吉姆萨原液。使用时0.3mL加蒸馏水10mL。血液涂片用甲醇固定510min，染液染1530min，重蒸水或PBS洗,示血涂片不同部位的染色效果,人血涂片染色结果,蟾蜍血,鸟血,鱼血,抗凝剂,第二节涂片法,第五章,二、对虾血淋巴涂片,1、血淋巴的采集,采血部位的选择：,心脏或血窦,一次性大量采血或做某些理化性质分析时从心脏取血。,要保持虾的活性从血窦取血。,据对虾体长选79号注射头,第二节涂片法,第五章,二、对虾血淋巴涂片,注意：血窦采血的部位应一致血窦采血，采血量不能过大大量采血时，在第1次抽血后停1min，再抽1次。,中国对虾血涂片，Giemsa染色,第二节,第二节涂片法,第五章,三、贝类血淋巴涂片（补充）,1、血淋巴的采集：闭壳肌,注射器中加抗凝剂或固定液,第二节,Wright-Giemsa染色,酶染色,密度梯度分离,流式细胞仪分类血细胞,第二节涂片法,第五章,第二节涂片法,第五章,四、刺参体腔液（体腔细胞）涂片（补充）,体腔液的采集：,从身体腹面或右侧用注射器抽取体腔液,注射器（25号针头）中吸入等体积抗凝剂或固定液,EM固定液；柠檬酸钠：3.8mgmL肝素钠：0.2-0.6mgmL草酸钠：1.0-1.5mgmL,刺参体腔细胞：小淋巴细胞、吞噬细胞、桑葚细胞和结晶细胞等,第三节分离法（自学）,借药物的作用，使组织软化、组织各组成部分之间的某些结合物质溶解，或用机械的方法，将组织的各个组成部分分离，并使其摊开于玻片上，制成临时或永久性封片。,如：肌肉纤维或神经纤维分离,第五章,第四节铺片法（自学）Spread,如：皮下结缔组织制片法,第五章,活体染色和铺片,C.T.铺片，VerhoeffVanGieson,ToluidineBlue,第五节滴片法,以滴片法制作鱼类或贝类等的染色体标本。,第五章,PHA,秋水仙素,第五节滴片法,第五章,原理：外周血小淋巴细胞，通常都处在G1期（或G0期），一般情况下不进行分裂。若在培养液中加入植物血球凝集素（PHA），小淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，低渗和固定，即可得到大量的有丝分裂细胞。,第五节滴片法,第五章,染色体制片材料的选择：,分裂程度高,细胞易于分散,含较少的间质和其它嗜碱性物质,染色体标本制备程序：,一、鱼类染色体标本的制备,第五节滴片法,第五章,胚胎(卵裂期或原肠期)，上皮细胞，鳃细胞，肾（头肾)细胞,1、材料选择：,注射部位,杀死鱼前810h或1618h,PHA(810g/g鱼体重)或酵母液(0.20.5ml/100g鱼体重),杀死鱼前45h，秋水仙素(35g/g鱼体重),取头肾,制备细胞悬液,0.075mol/LKCl，低渗,加固定液静置2030min，重复2-3次,冷滴片,Giemsa染色,第五节滴片法,第五章,第五节滴片法,第五章,二、贝类染色体的制作,材料选择：卵胚、幼体（囊胚期担轮幼虫期）、鳃、生殖细胞,（48细胞期卵胚）,4细胞出现后1025min，每隔5min处理一批（0.030.04%秋水仙素，30min）,热滴片,皱纹盘鲍,7%MgSO4或MgCl2麻醉后取鳃,活体解剖取鳃,50%海水配制的0.04%秋水仙素，30min,低渗:25%海水，30min,固定：carnoy氏液,将鳃放入50%冰醋酸解离，细胞浓度（50150）104个/ml,热滴片,Giemsa染色,三、对虾染色体制片,第五节滴片法,第五章,材料选择:胚胎和幼体；幼虾；成虾时期选精巢、中肠、触角腺或鳃,原肠期至肢芽期胚胎,无节幼体,0.02%秋水仙素（海水配),雄虾注射秋水仙素（1.5g/g虾体重),4-6h后取精巢,低渗,固定,滴片,50%醋酸解离,材料：主要选择分裂旺盛期的组织如：棘皮动物的胚胎、幼虫，成体的鳃、性腺等，海参采用后期幼虫、耳状幼虫、成体呼吸树组织等,四、棘皮动物染色体标本的制备（补充）,第五节滴片法,第五章,5.固定液及固定时间,总结：影响染色体标本制备效果的因素有哪些？,1.材料种类选择及处理方法,2.PHA或秋水仙素的浓度、作用时间,3.低渗液种类、浓度、作用时间