清洗与消毒

第四章 清洗与消毒,一、清洗 主要针对新的或重新使用的器皿，清除杂质和微生物，使其不残留任何影响细胞生长的成分。有害物质：微生物 细胞残余物 非营养成分的化学物质,1.玻璃器皿的清洗 浸泡刷洗浸酸冲洗 要求：干净透明、无油迹，不能残留任何物质2.橡胶制品的清洗 0.5mol/L NaOH煮沸15 min流水冲洗 0.5mol/L HCl浸泡15 min流水冲洗 自来水冲洗2次蒸馏水清洗2 3次 50烤干备用。3.不锈钢除菌滤器的清洗 新的或使用后的滤器流水冲洗15min去离子水浸泡24h三蒸水浸泡24h 干燥备用。,成分 强酸清洁液 次强酸清洁液 弱酸清洁液重铬酸钾（g) 63 120 100硫酸(ml) 1000 200 100蒸馏水(ml) 200 200 1000,二、消毒和灭菌 主要针对微生物污染 物理消毒法 1.紫外线消毒 是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物，多用于无菌室空气、地面以及超净工作台面的消毒。消毒效果与辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随距灯管距离的增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。 缺点：穿透力弱；产生臭氧，污染空气，对身体有害。,2.电离辐射灭菌 以射线、X射线和电子加速器产生的加速离子辐照物品杀灭微生物的方法。优点：灭菌时物品不会升温，尤其适用不耐热物品的消毒；辐射的穿透力强，可直接对密封包装的物品进行消毒。缺点：由于电离辐射有较强的诱变作用，不适合消毒活的生物材料。适用于消毒量大和不适做高压或滤过等培养用品。,3.湿热消毒 以高压（103.4kPa)蒸汽灭菌最为常用，是最有效的一种方法。压力蒸汽灭菌器消毒好的物品应注意烘干。 4.干热消毒 电烤箱160以上，保持90120min，才能杀死细菌芽胞，达到灭菌目的。 适用于玻璃器皿的消毒。 5.过滤除菌 主要用于培养用液的除菌。 化学消毒法 采用化学消毒剂消毒那些不能用物理等方法消毒的物品和场地，如无菌室的空气、台面、操作者的皮肤等。 抗生素的应用 主要适用于培养用液的消毒。,消毒灭菌物品 压力蒸汽 干热 过滤 紫外线 化学 化学 电离 抗生素 气体 消毒剂 辐射培养室、工作台 + + +玻璃制品 + + +金属器械 + + + +塑料用品 + + +橡胶制品 + + + +培养用液 + +布类、棉类 + +,第五章 体外培养的 基本技术,一基本操作 要点：无菌操作 取材： 含有维持液或BSS的无菌标本瓶 。 除去组织表面上的血块和血迹，尤其 开放性器官来源的组织。 超净工作台内进行操作。 1cm3组织块。 取材后立即培养，否则4保存，以 不超过6h 为宜。,（一）组织的分离,原则： 获取单细胞 同时尽可能不损伤细胞 常用方法：,1离心分离法：适用于血液、羊水、胸腹水细 胞的培养。注意： 低速离心，通常5001000 rpm/min， 510min. 悬液量大时，离心时间 适当延长。 淋巴细胞分层液利用血细胞比重不同，使各 类细胞分开。 微量全血法LC培养时，不必进行 LC分离。,2切割分离法：用眼科剪或手术刀。 组织块培养时，剪切成1mm3大小的组织块。 所取组织多为1cm3，注意用Hanks液漂洗。 3机械分散法： 挤压法，适用于软组织（如脑组织），用注 射器粉碎组织。 不锈钢纱网（1mm、100m、20m网眼）仅适用于处理软组织，对较硬组织和纤维组织效果不好，网眼越小对组织的损伤越大。,4消化分散法：应用酶进一步分散小块组织的方法最终使被处理的组织分散成细胞团或单个细胞制成细胞悬液进一步培养。 （1）胰蛋白酶消化法： 与胰酶不同（胰酶除蛋白酶外，还 包括淀粉酶和脂肪酶） 适用于消化细胞间质较少的软组织， 如胚胎组织、肝、肾等组织，对单层 细胞的作用也较好。, 对纤维性组织和较硬的癌组织的消化 作用较差 Ca2+、Mg2+对胰蛋白酶的活性有一定 的抑制作用，故需用D-Hanks液配制。 血清可抑制胰蛋白酶的活性，因此细 胞传代时，用胰蛋白酶消化细胞后，不必用Hanks冲洗。 两种消化方法 温消化：37，1h 冷消化：4 ，1220h,（2）胶原酶（Collagenase）消化法： Collagenase是一种由细菌提取出的酶，适用消化纤维组织、癌组织和上皮组织。消化作用缓和，无需振荡。 使用浓度200u/ml或0.10.3mg/ml，可与胰蛋白酶混合应用 。,Trypsin Collagenase 消化特性 适应于消化软组织 消化纤维多的组织使用浓度 0.010.5% 0.10.3g/ml消化时间 0.52h 112hpH 89 6.57.0作用强度 强烈 缓和细胞影响 时间过长有影响 无大影响血清抑活 有 无Ca2+和Mg2+ 有影响 无影响,(3) EDTA消化法： 非酶性消化物，用无Ca2+、Mg2+液体配制 螯合组织生存环境中的Ca2+、Mg2+ ，促进 细胞分散。 与胰蛋白酶按1：1或2：1比例使用 EDTA消化细胞后，一定要用Hanks液冲洗 干净，因培养环境中残留的EDTA对细胞 生长有不良影响。 消化传代细胞，不用来消化新鲜组织 。,（二）细胞计数法 1细胞活力检查：0.4%Trypan Blue（台盘蓝） 与细胞悬液按1：10比例混合，健康的活细 胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均 为不健康细胞。 2细胞计数： 如偶见由两个以上细胞组成的细胞团，按 单个细胞计算，若细胞团数10%，说明消 化不充分，细胞数少于200个/10mm2或大于 500个/10 mm2说明稀释不当。,3. 结果分析 细胞死亡后，细胞膜通透性增加，台盘蓝进入细胞，导致细胞蓝染。 台盘蓝染色法是一种粗略检测细胞存活的方法，不能准确反映细胞活力差异。 细胞活力（%）（总细胞数着色细胞数）总细胞数100%4. 注意事项：含有台盘蓝的细胞悬液不宜放置时间过长，否则正常细胞可摄取染料，影响染色结果。,(三) 细胞冻存1 原理：不附加任何条件下，直接冻存细胞 时，细胞内外环境的水会结成冰晶， 能导致细胞发生一系列变化，如机 械损伤、电解质升高，渗透压改变、 脱水和PH改变等 细胞死亡。 如向细胞培养液中加入保护剂甘油或DMSO，可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前渗出细胞外，避免细胞损伤。,2. 材料 仪器设备： 液氮罐、超低温冰箱（-7085） 冻存管：容量为12ml 消化液：0.25%胰蛋白酶或与0.02%EDTA混合的消化液 冻存液: 培养液、FBS和DMSO或甘油 待冻存细胞,3 注意： （1）细胞在-50最易受损 （2）为保存细胞最大存活率，一般都采用慢冻快融的方法，掌握好冻存速度。 （3）冻存一年后，应再复苏培养1次，然后继续冻存 。 （4）待冻存细胞应具有较高的活力，即处于对数生长期的细胞。 （5）常温下DMSO对细胞有毒副作用，因此冻存液需在4下放置4060min后使用。,4 冻存程序：,选取对数生长期细胞（收集前24h换液1次）,离心去上清，加细胞冻存液,密封, 放入液氮，标明细胞名称、存放日期,分装入2ml无菌螺口冷冻管，每管1.5ml细胞悬液,细胞计数：常规法制成细胞悬液（107/ml）,（四）细胞的复苏,自液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37 水浴,离心管吹打、漂洗，5001000rpm离心5min,吸出细胞悬液，补加10ml细胞培养液,again,加适量培养液稀释（1：10或1：20），分装细胞培养瓶（细胞密度5105个/ml）,37，次日换液,【结果分析】 1. 细胞存活率 用台盘蓝染色法检测复苏细胞的活性，细胞存活率（%）未着色细胞总计数细胞100% 2. 复苏效果取决于复温速度。【注意事项】 1. 必须在12min内使冻存液完全融化，如果复温速度太慢，则会造成细胞损伤。 2. 注意防护,（四）细胞运送,两种方法 1. 液氮或干冰保存，由于二者蒸发较快，用小 液氮罐较麻烦，只适于空运。 2. 充液法 ： 80%90%细胞汇合时，换新培养液。 到本实验室后，留正常量培养液，37培 养，液体分批用。,二常规细胞培养法（一）原代培养法： 1. 消化培养法 主要用品： 新鲜组织 0.25%胰蛋白酶 Hanks液 含10%20%牛血清的培养液 吸管、培养皿、瓶和不锈钢筛网等。,（2）流程：（注意无菌操作）,15cm3新鲜组织用Hanks液漂洗23次,眼科剪将组织剪成约1mm3的小块,加30倍原组织块的胰蛋白酶,温消化37，14h 或 冷消化4 ， 6 24h,不锈钢网滤过除去大块组织,所得细胞悬液5001000rpm，5min,弃上清，加适量营养液，吹打均匀制成细胞悬液,计数（5105个/ml），细胞密度过大时，补加营养液调整,37培养，注意PH值,例 乳鼠肾细胞原代培养 准备工作 培养用品消毒后，放在超净工作台内 紫外线消毒，做好各项准备工作. 点燃酒精灯，用品按布局放置，安装 吸管等, 采用颈椎脱臼法，将一只新生乳鼠处死 将小鼠进入盛有酒精的烧杯中数秒 置超净工作台内, 打开消毒器械包 用镊子掀起乳鼠腹部皮肤,用解剖剪剪开腹腔,充分暴露腹腔. 用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧,充分暴露位于腹腔背壁脊柱., 取下双侧肾脏,放入消毒培养皿中 用吸管吸取PBS加入培养皿中,清洗肾脏3次,尽量去掉血污。 将肾组织用解剖剪剪成几块，再用PBS漂洗，洗净血液为止。,胰蛋白酶消化 将洗净的组织块移入消毒小瓶中,用眼科剪剪切至0.5mm大小的组织块。 加入1020倍体积的0.25%胰蛋白酶，放入37水浴中消化3060分钟,注意应每隔1015分钟振摇1次。 当组织块变得疏松,颜色略白时，取出置于超净工作台内用吸管反复吹打组织块,使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态 加入12ml培养液终止消化，净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉,将上部的组织悬液移入无菌离心管中。,离心及计数 以8001000r/min离心810min,超净工作台内开盖,取上清加入适量培养液,细胞计数后分装。 在细胞瓶(板)上标明细胞名称，代数，日期。 倒置显微镜下观察细胞分散情况后置37孵箱中培养。,细胞观察 培养细胞每天观察，检查：A.污染与否? B.细胞生长状态 如见培养液变为黄色且又混浊，为污染;如培养液为桔红色，表明细胞状况良好。在无污染时，4h内有细胞贴壁，圆形悬浮状的细胞延展成多角型。 培养3-4天，细胞生长繁殖，可见细胞岛形成。细胞透明，颗粒少，界线清。 由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时应换液。,特点： 刚刚离体，生物学性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态，适于做药敏试验。 异质性，多种细胞混合形成。,2 组织块培养法 不用消化液 尽可能剪碎 两种技术： 翻转干涸法37 薄层营养液培养法,小结 动物细胞的培养步骤： 切取拟培养的动物器官或大组织块 洗去血污 剔除多余成分切成约1mm3大小的组织块 将所有组织剪碎用于组织培养 蛋白酶溶液消化 机械方法吹打组织块 离心、培养液悬浮 计数、调节细胞密度 用于分离细胞培养,（二）传代培养法： 细胞达到80%以上汇合时是理想的传代阶段。 1. 用品： 单层细胞 胰酶或EDTA Hanks液 细胞培养液 2流程：,弃去细胞培养瓶中营养液,加适量消化酶,胞质回缩，细胞间隙增大时中止消化,弃去消化液，加Hanks液轻洗单层细胞,用吸管吸取营养液轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱落制成单细胞悬液,分装细胞培养瓶，37,3注意： 掌握好传代时机，90%左右汇合（过早细胞数量少；过晚细胞健康状态不佳） 消化时间适度（过短细胞不易从瓶壁脱落；过长细胞脱落流失受影响） 消化液浓度要适宜 不同细胞对消化液的反映不同,（三）特殊培养法 1二倍体细胞培养法：是指培养的细胞始终维持二倍体生物学性状的培养方法。 正常细胞的原代培养即为二倍体细胞，但长期旺盛地增殖生长，并保持二倍体性状并非易事。 措施： 低温冻存：, 采用妥善的培养方法： 严格控制PH，最好CO2培养箱。 换液时间间隔不能太长，部分换液。 高质量血清和培养基，尽量维持不变。 每次传代均一分为二（细胞数量、营养液量、培养瓶空间和面积不变）。 掌握好传代时机，细胞不能过于密集，应及时传代。,2加支持物培养法： （1） 玻璃片：便于进行各种固定、染色处理和观察。 （2） 聚四氟乙烯：适于做电镜技术，可以进行包埋和切片。 特点： （1）可在任何时间取出支持物，做各种观察和实验 （2）需将支持物处理干净，避免不利因素影响细胞贴附和生长。,3单细胞分离培养（细胞克隆） 细胞群体单细胞培养新的细胞群体 纯系 原则：保证分离出的细胞确为一个 克隆形成率（Coloning fficiency）： 细胞群中单个细胞形成克隆的百分数称 克隆形成率。,理论上各种培养细胞都可进行克隆培养，但原代培养细胞和有限细胞系较困难，而无限细胞系和肿瘤细胞则较容易，因此对环境适应性强和具有较强独立活能力的细胞均易做细胞克隆。 无限细胞系，不低于10%； 原代细胞、有限细胞系，0.55%。,Coloning Efficiency,培养基：自制适应性培养基是一种不含 细胞而已被细胞生活过或同化过的培养基。,选取指数生长期细胞,换培养液1次,继续培养2448h后，吸取所有培养液,3000rpm，10min, 提高克隆形成率的措施,上清用0.22m微孔滤膜过滤,低温保存备用,用时取1份适应性培养基+2份新配制培养基混合使用,血清：胎牛血清小牛血清马血清，灭活处理56，0.5h.,激素：含110u/ml的胰岛素培养液能促进很多细胞克隆的形成CO2：CO2对绝大多数细胞克隆形成率都有提高，多用5%，成纤维细胞和胶质细胞2%.适应性底物：无限细胞系塑料底物；原代培养细胞胶原层或血浆 纤维蛋白层。, 方法：,48孔或96孔塑料细胞培养板,（培养612h后）镜下检测每孔所含细胞数，标记下含单细胞孔,制备低密度的细胞悬液（10个细胞/ml）,每孔接种100l细胞悬液,37培养,标记孔细胞增殖成群即为细胞克隆,扩大再培养, 注意事项： 确为一个细胞后方可进行标记 注意观察孔底边缘部位 选健康细胞的孔标记 4悬浮培养法 悬浮生长型：离心去除旧培养液添加新培养液混匀分装即可 贴附生长型：干扰细胞贴附，方可形成悬浮生长状态。,第六章 细胞培养的污染、检测和排除,一污染种类： 微生物：细菌、真菌、支原体和病毒等 化学物质：影响细胞生存、非细胞生存所需 的化学成分 细 胞：非同种的其他细胞,二污染途径： 1空气：超净工作台，净化工作区域的空气，每立方米内含菌数不应超过5个。 2消毒：不彻底，清洗不干净。 3操作：细胞交叉污染 系统污染 微生物污染 单一污染 4血清：实验材料质量不过关，以支原体最 为常见。 5组织标本：取组织时的污染或取自开放性器官的组织,三污染对培养细胞的影响： 1 细胞受有害物污染时间短，程度轻并能及时排除污染物的情况下，部分细胞可恢复，特别是化学物污染。 2污染物持续存在于培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分裂象减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，胞浆出现较多的颗粒；污染较重时，细胞增殖停止，分裂象消失，胞质中出现大量的堆积物，细胞变园、脱落或崩解。,3有的微生物如支原体，无致死毒性，可与细胞长期共存，但对细胞形态和功能有潜在影响。 不同污染物对细胞的影响有差别，可通过目测、显微镜观察、电镜观察、特殊染色鉴定、微生物培养实验、免疫学和分子生物学实验等。,四微生物污染的预防和排除： 防止污染，预防是关键为主 1.器皿准备中的预防 严格清洗、严格消毒。 2. 操作前的预防 保证超净工作台的空气净化标准，定期更换滤膜。 检查培养器皿是否有消毒标志，有条件尽可能用一次性无菌器皿。 新配制培养液的无菌实验。 紫外线提前消毒。 3.操作过程中的污染,4. 其他方面的预防 及早冻存有价值的培养物； 血清灭活； 定期消毒CO2培养箱。 污染的排除 若受污染细胞价值不大，并易从其他实验 室获得或买到，弃之。 容易建立者，可重新培养。 贵重细胞、单抗细胞，有必要进行污染 排除,排除方法： 抗生素除菌法： 大剂量（510倍）作用 2448h，再换液 联合用药 动物体内接种除菌法：适用于肿瘤细胞 加温除支原体：41，510h，最大可达 18h，但对细胞也有影响。,第七章 体外培养的基本组织,1 正常细胞培养 一上皮组织 上皮组织由排列密集而规则的细胞和少量间质构成，细胞之间借粘着物和特殊连接结构相连。 分布于人体或动物体的外表面和管、腔、囊的内表面，按照细胞的层次可分为单层上皮和复层上皮。 特征性生长状态：膜状生长（细胞紧密相连），细胞数量多时最为明显；不规则多角形，呈铺路石样；以及“拉网”现象（Netting）。,上皮细胞培养的3个要点： 需特殊底物； 需特殊培养基； 如何纯化和延长上皮细胞生存期。（一）表皮细胞培养 表皮属于一种角化的复层扁平上皮，由角质形成细胞和非角质形成细胞组成。角质形成细胞呈层排列，皮肤的干细胞位于角质形成细胞的基底层，具有活跃的增殖能力。真皮组织对表皮基底层细胞的分裂增殖具有直接的影响。,表皮细胞培养的要点: 早产胚胎皮肤组织最为理想 培养液：DMEM/F12(3:1，V/V)、胰岛素、转铁球蛋白、氢化可的松、促表皮生长因子(EGF)，可以采用NIH3T3为滋养层细胞。 胶原酶消化效果较好。 排除成纤维细胞的处理。 选用不含血小板生长因子的无血清培养基。,（二）乳腺上皮细胞的培养 乳腺主要由腺上皮组成，培养成功时可获纯上皮细胞培养物，既可培养正常乳腺，也可利用乳腺癌组织。 1.选取脂肪少，腺体组织多的部位，尽可能剥除脂肪组织（易培养），正常乳腺组织宜用胶原酶消化法。 2.培养乳腺癌组织可用两种培养方法：,直接培养法：适用于含纤维少的软组织，剪切成碎片加培养液，吸管吹打吸除上层非腺细胞成分反复23次无菌纱布滤过调整好细胞团块浓度移入细胞培养瓶中37培养。 胶原酶消化法：适合于含纤维多的癌组织。 3. 对塑料底物的贴附甚牢不易解离，在接种底物上铺以胶原层较好，既利于乳腺细胞生长，也易使细胞分离制成悬液。,4. 培养液： RPMI1640+胎牛血清，补加胰岛素、氢化可的松有利于乳腺上皮细胞生长。无血清培养基+EGFC（上皮细胞生长因子）、胰岛素、氢化可的松，猪促乳素和前列腺素均可。,（三 ）肝细胞培养 1. 肝细胞易于生长，能获得典型上皮细胞培养 2. 初代培养 原代组织块培养：1mm3小组织块，效果较好。初代消化法培养：胰蛋白酶、胶原酶均可 3. 易传代形成细胞系，常用培养基为RPMI1640。,（四）内皮细胞培养 1材料：人脐静脉，动物大动脉 2常用方法为灌流消化法，消化用酶为胶原酶，消化时间通常310min，首次用胶原酶消化时，须做预试验，以找出最佳消化时间，防止消化不足细胞未脱落，也可避免因消化过度使内皮细胞底层成纤维细胞混入。 3. 人脐静脉培养效果好，细胞生长后，一般传67代后即衰退，难以长期维持。兔血管内皮细胞可传1030代。,（五）胃黏膜上皮细胞的培养 1.材料来源 胚胎胃黏膜、手术切除组织。 2.1% 胶原蛋白或1%明胶涂布瓶壁。 3.消化液：型胶原酶和透明质酸酶，DMEM配制。 4.培养液：DMEM和F12按1:1混合，添加5% FBS、胰岛素、转铁蛋白等。 5.结果分析：培养24小时后细胞贴壁生长，多呈小片状。胃黏膜上皮细胞呈梭型或多角型，胞质透明；培养1周后细胞生长达高峰。,6.胃黏膜上皮细胞的鉴定 角蛋白免疫组化染色胃黏膜上皮细胞呈阳性反应。 粘蛋白组化染色显示培养的胃黏膜上皮细胞主要为分泌黏液的细胞。 7. 注意事项： 注意消化酶的选择和控制消化时间。 正常胃黏膜上皮细胞一般采用原代培养。,二、结缔组织 包括固有结缔组织、血液、淋巴液、软骨和骨，由细胞和细胞外基质构成。结缔组织的细胞主要有成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞以及软骨和骨细胞等。（一）成纤维细胞培养： 1.包括人在内的各种动物成纤维细胞都易培养，也往往是其他组织培养时的副产品。 2. 生物学性状改变，不易发生转化，人的二倍体细胞主要为成纤维细胞。,3. 常用胰蛋白酶消化法。4. 人胚肺、幼儿包皮和扁桃体组织。5. 可采用真皮片进行培养，细胞以真皮片为中心向四周生长，呈梭型或不规则型。6. 采用皮肤组织进行成纤维细胞培养时应尽量剥除皮下组织。,【原创】人成纤维细胞HF 1.细胞种类：人成纤维细胞； 2.培养天数：7d； 3.放大倍数：1010；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清； 5.细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，贴壁生长,（二）巨噬细胞培养 M属免疫细胞，具有多种生物学功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要实验工具。 1. 来源于人胸水、腹水、血液和透析液等，实验多用小鼠腹腔渗出物，不加任何刺激物的情况下，一个小鼠腹腔可含有23106个细胞，也无炎症反应。若欲获取多量M，可于取材前向小鼠腹腔注射刺激物，通常取细胞前向动物腹腔内注射510ml 4%硫代乙醇酸盐。 全血的缺点是混有其他细胞。,2.其他细胞（LC、NC、PC和成纤维细胞等）成分的排除，大多数巨噬细胞有极易附着培养器皿表面的特性，可用附着分离法去除其他细胞成分。 3.对胰蛋白酶和EDTA均不敏感，借此可与其他细胞相区别，也是淘其他细胞的方法。 4.正常M能附着瓶壁，胞质延展，胞质有皱褶，胞核呈特有的肾形，细胞较多时可形成单层，有时细胞呈多角形并连接成网状。,5强烈的吞噬活动，如向培养中加入淀粉、乳胶粒和红细胞等，可见巨噬细胞能吞噬5个以上的颗粒。6直接从腹腔获取的巨噬细胞为静止性细胞，呈圆形，伪足不明显。经硫代乙醇酸盐诱导可获得大量的炎性巨噬细胞，细胞多呈梭型，有较强的运动和吞噬能力。,(三) 成骨细胞的培养1. 取材: 胚胎或手术切除之骨组织。多选扁骨或长骨。2. 胰蛋白酶或胶原酶。3. 原代培养: (1) 植块培养法 成骨细胞具有迁移生长特点 (2) 分离细胞培养法 贴壁生长的成骨细胞为梭型或多边形, 单层铺满培养瓶后可出现重叠生长。传代细胞形态与原代同。4. 骨膜内层含有大量的骨原细胞，而成骨细胞是由骨原细胞增生分化而来，故亦可取骨膜进行培养。骨膜内成骨细胞含量丰富，培养的细胞可用于临床移植。,5. 成骨细胞的鉴定 碱性磷酸酶染色时，成骨细胞的胞质及其周围基质呈阳性，但成纤维细胞染色呈阴性。也可用盖玻片培养，利用免疫学方法标记细胞内的骨钙素，以鉴定成骨细胞。6. 培养的成骨细胞中常混杂有成纤维细胞，可利用差速黏附法除去成纤维细胞。成纤维细胞在510min内贴壁，而成骨细胞贴壁较慢。,（四）软骨细胞的培养 软骨由软骨细胞和软骨基质组成。在软骨移植及软骨病发生机制的研究中，常需借助体外培养技术获得保持着分化特性的软骨细胞。 1. 取材:胚胎或幼体的关节软骨及成人手术切除软骨。 2. 0.2%的型胶原酶消化。 3. 培养液可选择Ham12、DMEM和 RPMI1640等，加20%30%小牛血清。,4.前三代生长旺盛，细胞 呈圆形或椭圆形,，可分泌较丰富的细胞外基质。传代后，细胞变为多角形，变为梭形，6代后以梭形为主，增生几乎停止。 5. 软骨细胞的鉴定 根据软骨细胞产生的细胞外基质酸性糖胺多糖、型胶原和型胶原来鉴定。细胞外基质含有酸性糖胺多糖时，甲苯胺蓝染色呈异染性； 应用免疫抗体法染色观察细胞外基质是否含有型胶原和型胶原。,三、肌肉组织（一）心肌细胞培养 1. 一般认为正常成年心脏的心肌细胞不再分裂，因此心肌细胞的培养多采用动物或人的胚胎心脏以及刚出生动物的心脏，取心室肌。 2. 原代培养的心肌细胞呈纺锤形，并常混有成纤维细胞和内皮细胞；根据心肌细胞较其他细胞成分贴壁慢的特点，可采用胰蛋白酶消化后反复贴壁法，淘汰掉非心肌成分。,3.培养成功时，可于相差显微镜下，观察到横纹；培养1周后可见有节律性收缩现象，细胞可因收缩运动从支持物上脱落。成簇的心肌细胞呈放射状排列，可呈现同步化搏动。 4. 心肌细胞的鉴定 PAS 染色显示心肌细胞中的糖原颗粒，以次鉴别心肌细胞与间质细胞；此外可应用HE染色观察心肌细胞的形态结构,(二) 骨骼肌细胞培养 胚胎大腿肌肉 胰酶消化 胶原底物可促进分化 多核纤维（细胞融合）可见横纹及收缩 现象（融合后23天） 可进行传代培养成为有限细胞系，但易 失去分化现象。,四神经组织细胞培养 神经组织主要由神经元和神经胶质细胞构成，两者有共存关系。后者主要有： 少突胶质细胞：产生髓磷质，有助于 神经元兴奋 星形胶质细胞：调节神经元兴奋时产 生的离子，为提供神 经元营养 小胶质细胞： 产生促神经元发展和 完成功能活动的细胞 因子,（一）神经元 为高度分化的细胞，在组织发生晚期已失去增殖能力，对生存条件要求较高，只有在适宜条件下，方可存活。 条件：1. 接种在胶原支持物上 2. 加入神经生长因子或胶质细胞因子 3. 但难以增殖，来源于胚胎的神经组 织也是如此。,(二) 神经胶质细胞， 较易培养，分少突、星形（易增殖）和小胶质三种。神经胶质细胞与神经元有共存关系。 1. 原代培养（神经元和胶质): 适用于研究神经元的功能活动和胶质细胞的关系，不传代时可培养36个月。神经元可出现一定的分化现象，但无增殖能力，最终衰退死亡；而神经胶质细胞尤以星形细胞能继续生存和分裂增殖。,2. 传代培养：神经胶质细胞是神经组织中比较易培养的成分，可传代形成二倍体细胞系。特点： （1）胶质细胞在培养中生长稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持良好的敏感性，能用Rous病毒和SV-40等诱发转化。 （2）贴壁过程较慢，细胞适应环境的时间较长，主要为星形胶质细胞形成连接不甚紧密的单层细胞。一旦生长，即能进入较旺盛的增殖状态。,2 肿瘤细胞培养 肿瘤细胞的培养在细胞培养中有核心的位置。 癌细胞较易培养，目前建立的细胞系主要是癌细胞系。 肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药物检测和癌细胞分子生物学的重要手段。,一体外培养肿瘤细胞的生物学特性 生长在体内的肿瘤细胞和体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同，培养中的肿瘤细胞具有以下突出特点： 1. 形态和性状：光镜下无特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察较二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜下细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走形不如正常细胞规则。,2. 生长增殖：与体内相同，生长失控，有以下特点： 自泌功能：癌细胞在低血清培养基中（25%）仍能生长 单细胞培养时形成克隆的能力比正常细胞强 正常细胞发生转化后，可出现能在低血清培养基中生长的能力，已成为检测细胞恶变的一个指标 接触抑制消失,3. 永生性或不死性：表现为细胞可无限传代而不发生凋亡（Apoptosis）或程序化死亡（PCD）。事实上多数肿瘤细胞初代培养也并不容易，生长并不旺盛增殖若干代后出现类似diploid cell培养中的停滞期过此阶段后才获得永生性。 从一些具有永生性而无恶性性的细胞如NIH3T3等细胞证明，永生性和恶性性是两种性状，受不同基因调控，但有相关性。,4. 浸润性：与正常组织混合培养时，能浸润入其他组织细胞中，并有穿透人工隔膜的能力。 5. 异质性：表现同一肿瘤组织内细胞的活力有差别，如处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区有的细胞衰老退化，只有增殖活跃的细胞才是支持肿瘤生长的成分如干细胞（Stem Cells）。（异质性是指肿瘤组织由增殖能力、遗传性、起源和周期状态等性状不同的细胞组成。） 6. 遗传特征：异倍体、多倍体。,二培养方法 肿瘤细胞培养成功的关键在于(具体方法与正常细胞无差别)： 1. 取材：要挑选活力好的部位，癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后需尽快培养，注意化疗后的肿瘤组织易坏死。,2. 适宜的培养基： 要求不如正常细胞严格 肿瘤细胞对血清的需求较低， 个别肿瘤细胞需特异性生长因子 3. 成纤维细胞的排除 是获得纯肿瘤细胞的关键。混杂时，成纤维细胞肿瘤细胞。排除方法多种：, 机械刮除法：标记肿瘤细胞生长部位去培养液无菌胶刮刮除（scraper）无标志空间Hanks液冲洗继续培养（可反复刮除） 胰蛋白酶消化反复贴壁法依据： 肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁慢 结合使用无血清或低血清含量培养基,单层细胞 Hanks液冲洗 加无血清培养基吹打细胞制成单细胞悬液 A培养瓶 37静置520min全部培养液移入B培养瓶 37静置520min全部培养液移入C培养瓶，A、B培养瓶补充完全培养液继续培养，次日观察。,A瓶主要为成纤维细胞， B瓶为两类细胞混杂， C瓶则主要为肿瘤细胞。 消化排除法：利用成纤维细胞对胰蛋白酶和胶原酶敏感的特点，以胶原酶较为常用，消化的同时注意在倒置显微镜下观察，可重复进行。 其他方法：聚丙烯酰胺、SOD等抑制成纤维细胞生长；聚蔗糖密度梯度离心。,三. 提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施适宜底物生长因子动物体媒介培养（裸鼠为佳）,四. 体外培养肿瘤细胞的生物学检测： 目的： 确为肿瘤细胞而非其他细胞 具某种肿瘤特异性 了解一般生物学性状 主要包括： 1. 异体动物接种致瘤（裸鼠） 2. 软琼脂培养 3. 核型分析 4. 细胞骨架和电镜分析 5. 癌基因和抗癌基因的分析,第8章 培养细胞性状的生物学检测 体外培养细胞的观察和检测研究方法非常多一细胞一般形态学观察（一）培养物的常用固定方法 ： 是细胞培养中常用的显示细胞形态的技术，固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶和变形等。能观察细胞的细微结构，可对细胞内的大分子物质准确定位，标本制好后可以长期保存和做长时间的观察、分析。,1. 固定组织、细胞的基本原则: 尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。 2. 单层细胞固定观察的特点: 细胞层次少，固定效果好。 单层细胞不需包埋和切片。 3. 培养物的准备和固定前处理 盖玻片单层培养时，固定前先用PBS液漂洗23次单层细胞，以洗去血清和细胞表面的残物。 悬液培养细胞时，先低速离心除去含血清的培养液，然后加 PBS溶液漂洗23次制成悬液涂片。,4. 常用固定液： 基本要求：维持细胞形态，不影响进一步实验。 分两类： 简单固定液：用单一化学物质配制而成，主要有甲醇、乙醇、甲醛、丙酮、戊二醛等 。 混合固定液：用两种或两种以上的化学物质配制而成，如Mueller固定液、Flemming固定液、FAA固定液 、Carnoy固定液等。不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同，因此选择合适的固定液是达到固定目的基础。,5.几种常用的固定液 4%甲醛-PBS： 甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含40%甲醛。用40%甲醛水溶液：PBS1：9配方制备甲醛固定液，对细胞染色体、线粒体和高尔基体的固定效果较好。 4%多聚甲醛-PBS固定液：多聚甲醛为白色固体，该固定液适于固定肾纤维蛋白和细胞骨架蛋白，进行核酸原位杂交时多用此固定液。 丙酮：多用分析纯的冷丙酮，固定细胞内酶的效果较佳，免疫组化时多用。, 戊二醛：对组织的渗透率高，与蛋白质反应快，能较好地保存蛋白质，对微管和膜性结构保存也比较好，透射电镜分析时常用。 甲醇/醋酸固定液：甲醇：醋酸为3：1的固定液是应用最广的一种培养细胞固定剂，甲醇穿透力好，醋酸固定核酸效果好，两者结合能使细胞形态固定不变。最适用于固定染色体，注意该固定液宜现用现配。,（二）染色方法 染色是利用化学染料与细胞及各种细胞器发生化学作用或吸附作用，使各种细胞结构能够通过染色改变其折射率，从而清晰地显现出来。染色有单染和复染两种。 1. Giemsa染色： 是最常用的方法之一，简便、快速，适用于多种细胞和染色体的染色。细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色。染色液宜现用现配，保存时间最好不要超过48小时。 2. 苏木精-伊红(HE)染色法: 较为常用，细胞核染成红色，细胞质染成蓝紫色。,3. Feulgen染色法: 是鉴别细胞中DNA的一种染色方法，DNA经弱酸（1mol/L HCl）水解后，DNA分子中的嘌呤和脱氧核糖键被打开，脱氧核糖的一端释放出醛基，并在原位与Schiff试剂发生反应生成紫红色产物。细胞核内DNA显紫红色，细胞质呈绿色（染色过程中用亮绿复染）。 4.丫啶橙（acridine orange，AO）荧光染色法：丫啶橙是一种荧光染料，与细胞内的DNA和RNA都有亲和力，但结合后却发出不同颜色的荧光，DNA呈亮绿色，而RNA呈橘红色至火红色。该法简便快捷，既可染活细胞又可染固定细胞。,5. 甲基绿-派若宁(methyl green-pyronin method)染色法: 甲基绿和派若宁为两种碱性染料，可与带负电荷的磷酸基形成盐。甲基绿分子有两个