生物选修1-2.1.pptx

专题2:微生物的培养与应用,了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。,一、课题目标：,掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。,无菌技术的操作。,二、课题重点和难点：,三、技能目标：,一、基础知识：,（一）培养基,1概念：人们按照微生物对的不同需求，配制出供其的营养基质叫培养基。按物理状态可分为培养基和培养基。,2营养构成：各种培养基一般都含有、和。此外还要满足微生物生长对、以及的要求。,例如：培养乳酸杆菌时需在培养基中添加，培养霉菌时需将培养基PH调至、培养细菌时需将PH调至、培养厌氧微生物则需提供条件。,营养物质,生长繁殖,液体,固体,水,碳源,氮源,无机盐,pH,特殊营养物质,氧气,维生素,酸性,中性或微碱性,无氧,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,固体培养基：菌落，菌苔,菌苔（lawn)细菌在固体培养基接种线上由母细胞繁殖长成的一片密集的、具有一定形态结构特征的细菌群落，是许多菌落连成一片形成的或者细菌在斜面培养基接种线上有母细胞繁殖长成的一片密集的、具有一定形态结构特征的细菌群落。一般为大批菌落聚集而成。,半固体培养基：,无动力有动力(弥散),(是否运动),半固体培养基用于观察细菌的动力，有鞭毛的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见羽毛状或云雾状浑浊生长。无鞭毛的细菌只沿穿刺线呈明显的线状生长。,培养基中的营养物质,（二）无菌技术,无菌技术的概念,即无菌操作，泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,成功地培养微生物的关键。,（二）无菌技术,阅读“无菌技术”，讨论回答下列问题：,1、获得纯净培养物的关键是，无菌技术主要包括哪些方面？,防止外来杂菌的入侵,（1）对实验操作的、操作者的和进行。,（2）将用于微生物培养的、和等器具进行。,（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在附近进行。,（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与相接触。,空间,衣着,手,清洁和消毒,器皿,接种用具,培养基,灭菌,酒精灯火焰,周围的物品,（）消毒定义：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。区分为高程度消毒（High-levelDisinfection）、中程度消毒（Intermediate-levelDisinfection）、低程度消毒（Low-levelDisinfection）三种方式。,1.消毒与灭菌的概念及两者的区别,（2）灭菌的定义：,以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,（二）无菌技术,阅读“无菌技术”，讨论回答下列问题：,2、消毒和灭菌,（1）消毒是指。常用的方法有、消毒法。,使用较为温和的物理或化学方法杀死,煮沸消毒法,巴氏消毒法,化学药剂,物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）,（2）灭菌是指。常用的方法有、灭菌。,使用强烈的理化因素杀死物体内外所有,灼烧灭菌,干热灭菌,高压蒸汽,微生物（包括芽孢和孢子）,消毒与灭菌有什么区别？,1、煮沸消毒法:100煮沸56min2、巴氏消毒法：7075下煮30min或80下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；用氯气消毒水源4、紫外线消毒,(1)消毒的方法：,2.常用的消毒与灭菌的方法,牛奶巴氏消毒法是法国人巴斯德于1865年发明，经后人改进，用于彻底杀灭啤酒、酒、牛奶、血清白蛋白等液体中病原体的方法，也是现世界通用的一种牛奶消毒法。巴氏消毒的目的是杀死牛奶中可能存在的所有有害微生物（包括一切致病菌）。在巴氏消毒法发明前，欧洲因喝生牛奶或吃乳制品而染结核病的人不计其数。由于当时还未发明抗菌素，因此，因结核病而死的人也是不计其数。但自从巴氏消毒法广泛应用以后，因喝牛奶而染此病的人已很少见。但现在世界上也有一些地方的人喜欢喝生牛奶，比如我国的内蒙。据科学家调查，在内蒙牧民肺结核病人中，有10.6%的患者有喝生牛奶的习惯。,知识拓展,巴氏消毒法还用于消毒啤酒、白酒等东西，经过巴氏消毒的啤酒叫干啤；不经巴氏消毒，只能冻藏保鲜的啤酒就是生啤。巴氏消毒的原理是什么？在一定温度范围内，温度越低，细菌繁殖越慢；温度越高，繁殖越快。但温度太高，细菌就会死亡。不同的细菌有不同的最适生长温度和耐热、耐冷能力。巴氏消毒其实就是利用病原体不是很耐热的特点，用适当的温度和保温时间处理，将其全部杀灭。但经巴氏消毒后，仍保存小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢，因此巴氏消毒牛奶要在4左右的温度下保存，且只能保存3-10天，最多16天。,什么是巴氏消毒？,知识拓展,目前国际上通用的巴氏消毒法主要有两种：一种是将牛奶加热到62-65，保持30分钟。采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%-99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌占多数的是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。第二种方法将牛奶加热到75-90，保温15-16秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。但杀菌的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。,什么是巴氏消毒？,知识拓展,巴氏消毒法的优点：巴氏消毒纯鲜奶较好地保存了牛奶的营养与天然风味，在所有牛奶品种中是最好的一种。只要巴氏消毒奶在4左右的温度下保存，细菌的繁殖就非常慢，牛奶的营养和风味就可在几天内保持不变。,什么是巴氏消毒？,知识拓展,1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160170下加热12h。3、高压蒸汽灭菌：100kPa、121下维持1530min.,(2)灭菌的方法：,5.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手,（1）需要干热灭菌；（2）需要干热灭菌；（3）需要化学消毒。,日常生活中保存食品的方法,(1)低温冷冻让微生物不容易生存或繁殖。(2)加入盐、糖可以使食物脱水。水分少，微生物就不容易生长。(3)酒及防腐剂会杀菌。(4)隔开空气，使微生物不容易附著生长。,巴斯德鹅颈瓶实验,19世纪60年代,法国微生物学家巴斯德(LouisPasteur,1822-1895)进行了著名的鹅颈烧瓶实验。鹅颈瓶实验是假设细菌、微生物的移动需要依靠菌毛、鞭毛，并且需要在有液体介质的情况下才能正常移动。他把肉汤灌进两个烧瓶里，第一个烧瓶就是普通的烧瓶，瓶口竖直朝上；而第二个烧瓶，瓶颈弯曲成天鹅颈一样的曲颈瓶。然后把肉汤煮沸、冷却。两个瓶子都没有用塞子塞住瓶口，而是敞开着，外界的空气可以畅通无阻地与肉汤表面接触。他将两个烧瓶放置一边。过了三天，第一个烧瓶里就出现了微生物，第二个烧瓶里却没有。他把第二个瓶子继续放下去：一个月、两个月，一年、两年直至四年后，曲颈颈瓶里的肉汤仍然清澈透明，没有变质和产生微生物.,鹅颈瓶实验的影响,证明自然发生学说的错误性。弯曲的瓶颈阻挡了外面空气中微生物直达有机物浸液内，一旦将瓶颈打断，瓶内浸液中才有了微生物，有机质发生腐败，巴斯德的实验彻底否定了自然发生学说并从此建立了病原学说，推动了微生物学的发展。巴斯特的细菌实验。放了几年的肉汤没有变质，把瓶子打开晃一晃肉汤很快就变质了。从而证明了食物变质与空气中的微生物有关。人们根据此原理想出了罐头，来保证食物长时间不会变质。,无菌技术,思考：,1.无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是什么？,2.利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是什么？,3.物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌时，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是什么？,有效避免操作者自身被微生物感染。,避免妨碍热空气流通,有利于锅内温度升高,4.高压蒸汽灭菌锅灭菌后，气压务必降至零时再打开锅盖，其目的是什么？,防止灭菌容器内的液体冲出容器，造成污染,二、实验操作大肠杆菌的纯化培养,阅读“实验操作”，讨论回答下列问题：,本实验所用的培养基是，本实验可分成和两个阶段进行。,（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,操作步骤是：、。,（二）纯化大肠杆菌,微生物接种：最常用的是法和法。另外还有穿刺接种和斜面接种等。,牛肉膏蛋白胨固体培养基,制备培养基,纯化大肠杆菌,计算,称量,溶化,灭菌,倒平板,平板划线,稀释涂布平板,牛肉膏蛋白胨培养基的制备,培养基配制原则培养基：培养基是提供食用菌等生物生长发育所需的营养与特定环境条件的基质，如蘑菇菌是有机营养型中的草腐生菌。制备培养基不仅要考虑它所需要的含碳化合物、含氮化合物、矿物盐类、生长因子，还要考虑水与pH环境，同时还应考虑它们培养方式是固体培养还是液体培养。因此，可以把按菌类生长发育需要比例配制的灭菌营养基质，称为培养基。换言之，培养基必须具备三个条件：含有菌株生长发育所需要的营养物质；具有菌类生长环境条件；经过灭菌，并保持无菌状态。,牛肉膏蛋白胨培养基的制备,基本原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广泛和最普通的细菌基础培养基，又称普通培养基。它含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCI。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCI提提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作为凝固剂。琼脂在常用浓度下96时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40时凝固，通常不被微生物分解利用。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其PH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。,牛肉膏蛋白胨培养基的制备,操作器材（1）溶液与试剂：牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1mol/LNaOH,1mol/LHCI。（2）仪器及其他用具：试管，锥形瓶，烧杯，量筒，玻璃棒,培养皿，天平，高压灭菌锅，PH试纸，棉花，牛皮纸，皮筋，纱布等。,1计算2称量3溶化4调pH、灭菌：pH765倒平板,制备培养基的操作步骤,可简称为：算、称、溶、灭、倒,牛肉膏蛋白胨培养基的制备,操作步骤1.计算根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制培养基时，各种成分的用量。,牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：,牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂15.020.0g水1000mlpH7476,牛肉膏蛋白胨培养基的制备,操作步骤2称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。,2称量*注意事项1.天平称量时，注意放等大的称量纸。2.牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖。3.称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。,牛肉膏蛋白胨培养基的制备,操作步骤3.溶化将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量的水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。往烧杯中加入称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使其溶化。在此过程中，不断用玻璃棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。当琼脂完全溶化后，补加蒸馏水至100ml。,3.溶化*注意事项1.在溶化时要用玻璃棒不断搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。,牛肉膏蛋白胨培养基的制备,操作步骤4.调pH值用酸度计或精密pH试纸测定其pH值，并用10NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。,牛肉膏蛋白胨培养基的制备,操作步骤4.灭菌将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121条件下，灭菌1530min。将培养皿用几层旧报纸包紧，58套培养皿作一包，包好后放入干热灭菌箱内，在160170下灭菌2h。,4.灭菌*注意事项,1.灭菌物体不要装的太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果,2.锥形瓶与试管口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包裹瓶口的纸而透入棉塞。,3.加盖时，要同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，不漏气,4.到灭菌时间后，等到压力表的压力降到零时，再打开排气阀。,干热灭菌,1.物品不要摆得太挤，以免妨碍热空气流通。,2.灭菌物品不要与干热灭菌箱内壁的铁板接触，以防包装纸烤焦起火。,3.温度未降到70以前，切勿打开箱门，以免玻璃器皿炸裂。,高压灭菌,5.倒平板操作,在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；,右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；,左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。,待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。,5.倒平板*注意事项,问题讨论,1.在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的称量操作中，动作要迅速，原因是什么？,2.溶化操作中需要不断用玻璃棒搅拌的目的是什么？,3.牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供什么等营养物质？,防止牛肉膏吸收空气中水分。,防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。,糖（碳源）、有机氮（氮源）和维生素（生长因子）,4.培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,5.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,6.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,7.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,1.平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,微生物的接种技术,平板划线的操作方法,平板划线的操作,1.将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。,2.在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。,平板划线的操作,3.将试管口通过火焰。,4.将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。,5.将试管口通过火焰，并塞上棉塞。,平板划线接种,第一区域,第二区域,第三区域,第四区域,第五区域,问题讨论,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后残留的菌种，（使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落）；划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少。每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.稀释涂布平板法:是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。,微生物的接种技术,1、梯度稀释,2、涂布平板,涂布平板操作,1.将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。,1.取少量菌液（不超过0.1mL），滴加到培养基表面。,3.将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810s中。,4.用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。,注意事项,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步（取少量菌液，滴加到培养基表面）应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,1、培养基制备成功的标准,2、接种操作成功的标准,如果未接种的培养基（作为对照）在恒温箱中保温12天后无菌落生长，说明培养基配制是成功的，否则实验失败，需重新配制。,如果培养基上生长的菌落颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明操作是符合要求的。如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，实验失败，需分析原因，再次实验。,培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,三、结果分析与评价,3、及时进行细致的观察与记录,三、结果分析与评价,4.菌落大小不同，产生差异的原因培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长，菌落的不断生长，使菌落不断增大。,5.未接种的培养基表面如果有菌落生长，说明了什么？未接种的培养基是不能有菌生长的，如果有菌生长则说明受到污染或者灭菌不彻底。不仅表面不能有菌生长，内部也不能有菌生长。,三、结果分析与评价,正确的做法是：配好培养基之后，将培养基放在温箱里培养24小时观察，长菌的培养基应该丢弃，无菌生长的方能使用。这样做的另一个好处是将培养基上的水气和培养基表面的水蒸发干，不会对细菌培养产生影响。,三、结果分析与评价,6.如果在培养基上观察到了不同形态的菌落，请分析其可能的原因。无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养过程中受到了污染。,1、临时保藏：适用于频繁使用的菌种。将菌种接种到固体斜面培养基，在适宜的温度下培养。当菌落长成后，将试管置于4的冰箱中保藏,课题延伸,2、甘油冷冻管保藏：适用于需长期保存的菌种。在3mL甘油瓶中，装入1mL甘油灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀，放20的冷冻箱中保藏,课题延伸,本课题知识小结:,微生物实验室培养的基本操作程序,1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存,【典例解析】,例1关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,D,例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前,B,解