CMV 2b蛋白互作寄主因子克隆及其沉默载体的构建.ppt

浙江理工大学,May25，2016,报告人：资瑞飞,浙江理工大学,May25，2016,3,5,愿景,浙江理工大学,报告人：资瑞飞,May25，2016,图1.黄瓜花叶病毒粒子电镜图,浙江理工大学,报告人：资瑞飞,May25，2016,图2.黄瓜花叶病毒粒子结构示意图图左侧为病毒粒子外部结构图右侧为病毒粒子内部结构,研究背景ResearchBackground,研究背景ResearchBackground,+,报告人：资瑞飞,浙江理工大学,May25，2016,2b蛋白是CMV重要的多功能蛋白，其大小约为1113kDa，由CMV基因组RNA2转录的亚基因组RNA4翻译产生，主要功能包括决定致病性、抑制RNA沉默和影响病毒的长距离移动等。,病毒侵染植物后，植物会产生以病毒基因组为来源的siRNA，这种类型的siRNA可以抑制病毒在植物体内的复制和系统侵染；该过程被称作抗病毒RNA沉默,CMV2b蛋白是最早被鉴定的沉默抑制子之一。,报告人：资瑞飞,浙江理工大学,May25，2016,实验室通过酵母双杂交发现CMV2b与拟南芥核糖体小亚基11（RPS11）发生互作，在此基础上：本课题利用常规PCR、分子克隆后浸润接种，探究RPS11与CMV2b是否互作,对CMV重要功能蛋白互作的研究，将促进CMV防治的研究进展。,研究内容及意义Researchcontents,技术路线TechnologyRoadmap,报告人：资瑞飞,引物设计,酵母双杂交法筛选所需cDNA,PCR扩增后转化到PUC19载体,提质粒后测序,BiFC克隆构建,浸润农杆菌接种,准备注射用植物,浙江理工大学,May25，2016,8,实验方法experimentalmethod,报告人：资瑞飞,浙江理工大学,May25，2016,9,实验方法experimentalmethod,报告人：资瑞飞,相关试剂配制LB培养基：胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g，Agar15g，水1000mL50TAE电泳缓冲液：242gTris碱，100ml0.5mol/EDTA（pH=8.0）,57.1ml冰醋酸，水1000ml。（使用时稀释到1TAE）TAE胶：琼脂糖1g/100ml,TAE抗生素：50mg/ml羧苄农杆菌浸润缓冲液:MES（0.5M）10mL,MgCl22.5mL,AC（0.2M）50uL,浙江理工大学,May25，2016,10,实验方法experimentalmethod,浙江理工大学,报告人：资瑞飞,浸润接种图示,May25，2016,（1）,（2）,（3）,（4）,（5）,实验结果-pUC19克隆Experimentalreason,图1.PCR扩增RPS11(945bp)的电泳结果,图2.菌液PCR鉴定结果,图3.pUC19-RPS11酶切鉴定结果,浙江理工大学,报告人：资瑞飞,May25，2016,123456,12345,实验结果-BiFC克隆experimentalmethod,pSP35SYNE-RPS11（左10个）、pSP35SYCE-RPS11（右10个）菌液PCR鉴定结果,浙江理工大学,报告人：资瑞飞,May25，2016,Mark12345678910空12345678910,1,（2）为pSP35SYCE-NbRPS11+pSP35SYNE-LS2b,PPT由MaiFUNG设计|Designer:MaiFungmaij1217,实验结果-BiFC克隆experimentalmethod,2,3,5,4,综上所述，进一步支持RPS11与CMV2b蛋白的分子互作,浙江理工大学,报告人：资瑞飞,May25，2016,13,（1）为pSP35SYNE-NbRPS11+pSP35SYCE-LS2b,结论：LS2b和NbRPS11无论在YFP的N端还是C端，都有荧光信号，说明拟南芥RPS11蛋白与CMV2b蛋白在本氏烟植物细胞内发生互作,（3）为pSP35SYNE-NbRPS11+pSP35SYCE,（5）pSP35SYNENbRPS11+pSP35SYNCE-NbRPS11,（4）为pSP35SYCE-NbRPS11+pSP35SYNE,结论：对照组均未观察到黄色荧光,总结conclusion,本实验主要探讨与CMV2b互作的基因，通过中间载体pUC19克隆后测序，正确片段再进行BiFC克隆，最后将要验证的两个基因注射烟草，观察互作结果，结果显示拟南芥RPS11蛋白与CMV2b在植物体内发生互作。本论文证实LS2b与拟南芥RPS11在植物体内发生互作，但是还需要体外实验，如pull-down或免疫共沉淀的方法做进一步的验证；在进一步确认