06 化学毒物的一般毒性作用-急性毒性PPT演示课件

第六章外源化学物的一般毒性作用,1,一般毒性,外源化学物在一定的剂量、一定的接触时间和一定的接触方式下对机体（实验动物和人类）产生综合毒效应的能力。化学毒物的一般毒性（generaltoxicity）又称为化学毒物的基础毒性（basictoxicity）或称为一般毒性作用（generaltoxiceffect）。,2,根据接触化学毒物的时间长短所产生的毒性效应，可划分为急性毒性、重复剂量毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。那么相应地，按接触化学毒物时间长短所进行的哺乳动物试验以观察毒效应、评价化学毒物综合毒性的试验即为急性毒性试验、重复剂量毒性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验。根据以上试验结果对化学毒物的毒性进行评价称为一般毒性评价（evaluationforgeneraltoxicity）。,3,第一节急性毒性作用,4,一、概念和试验目的,1概念急性毒性（acutetoxicity）是指机体（实验动物或人）一次接触或24小时内多次接触一定剂量外源化学物后在短期（最长到14天）所引起的机体的毒性效应（包括一般行为、外观改变、大体形态变化等），以及死亡效应。也有对急性毒性试验的期限用规定的时间内来表示，而没有限制时间。,5,实际工作中，机体接触化学毒物的方式或途径不同，急性接触的含义也有所不同。一次接触是指瞬间给实验动物染毒，如经口染毒、经注射途径染毒。经呼吸道与经皮肤染毒而言，则是指在一个特定的期间使实验动物持续地接触化学物的过程。当化学物毒性很低，需要给予动物较大剂量时，可在24小时内分多次给予，这时的急性接触即为“多次”，一般不超过三次。,急性接触的次数,6,中毒效应出现的时间,急性毒性效应一般是指机体接触化学物后，在较短时间内观察到的毒性症状。有的化学毒物在实验动物接触几分钟内即可产生严重中毒症状，甚至瞬间死亡；而有些化学毒物几天、十几天后动物才产生明显的中毒症状和死亡，呈现迟发毒效应。有的化学毒物在出现快速和剧烈的毒效应后很快恢复；有的化学物早期仅有较轻微症状，几天后又出现严重中毒症状甚至死亡。在实际工作中，大部分毒物的急性毒性症状在短期内出现。一般为714天，如有必要可延长至14天以上。,7,2急性毒性试验的目的,测定毒物的致死剂量以及其他急性毒性参数，LD50为最主要的参数，并根据LD50值进行急性毒性分级。其他毒性参数还有LD100、LD01、LD0等。通过观察动物中毒表现，毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量-反应（效应）和对人类的潜在危险性程度。为重复剂量、亚慢性和慢性毒性研究及其他毒性试验提供接触剂量的设计依据，并为观察指标的选择提出建议。为毒理学机制研究提供初步线索。,8,3有关急性毒性试验的常见概念,9,通过外源化学物的急性毒性试验，可以得到一系列的毒性参数：,急性毒性上限参数，以死亡为终点绝对致死剂量或浓度（LD100或LC100）；半数致死剂量或浓度（LD50或LC50）；最小致死剂量或浓度（MLD，LD01或MLC，LC01）；最大耐受剂量或浓度（MTD，LD0或MTC），或称为最大非致死剂量（MNLD）。,10,急性毒性下限参数，以非致死性急性毒作用为终点。急性毒性LOAEL(观察到有害作用的最低剂量)；急性毒性NOAEL(未观察到有害作用的剂量)。,11,因此，急性毒性试验可以分为两类。一类是以死亡为终点，以检测受试物急性毒性上限指标为目的的试验，这类试验主要是求得受试物的LD50值。另一类急性毒性试验检测非致死性指标。,12,二、实验动物选择,13,1选择原则,一般原则：毒性反应与人相近。操作方便，易饲养和管理。品系纯，价格低，易获取。选择两种（啮齿类，非啮齿类）以上动物分别求其急性毒作用参数。其他条件选择：年龄：刚成年的健康动物；性别：雌、雄各半；雌、雄分笼喂养；分组：随机分组；检疫期：12周。如是狗，则须检查肠道寄生虫或直接驱虫治疗。,14,2选择方法,种属的选择：动物的种属很多，脊椎动物的大小、生命周期、生育行为都较为适宜，有些已被训化，有利于被培育成标准动物。最主要的急性实验动物是大鼠，几乎占全世界所报导的研究外来化合物急性毒性试验的一半，占第二位的是小鼠。,15,为什么要选大、小鼠呢？,因为它的毒性反应与人较为一致，而且繁殖快、易饲养、价格便宜且易获取。使用实验动物来推论于人必须慎而慎之。因为动物的反应敏感性一般不及人。曾有报导发现有138种化合物人对之反应比大鼠更为敏感。,16,人与大鼠对不同化合物的急性毒性敏感比值（*以大鼠为1，人：大鼠）,17,另外，由于不同种属动物其生理状况不一，在做实验时要考虑到实验的需要，引起注意：啮齿类动物：无呕吐反应猫、狗：呕吐反射灵敏，可用于研究引发呕吐的实验。兔、豚鼠：多用于经皮肤接触的毒作用研究。猴：用于一些特殊的实验。,18,年龄和体重的选择,急、慢性实验动物年龄、体重选择,19,实验动物分组与数量,在利用不同的方法测定化学物LD50时，实验设计中对动物数的要求不同。一般要求雌雄兼用，每个剂量组每种性别至少5只动物，至少设置3个不同的剂量组（一般为5-7个剂量组）。霍恩氏法测LD50时要求有4个剂量组，每组4只或5只动物。概率单位法、Bliss法测定要求5-7个剂量组，每组10只或10只以上动物。对于不同的化学物测定应根据其相应的试验规程确定实验动物数量。,20,1）初设剂量组以了解的LD50值为中间剂量组的剂量，按一定的比值，再向上或下各推1-2个剂量组，开始时，组距要稍大些。举例：某受试物相关文献查阅结果，其大鼠经口LD50约为40mg/kg，按此剂量倍数差来划分上下各两组（lg4=0.6）,21,22,如果估计受试物致死剂量范围较窄，也可将组距缩小。例如用对数值0.2为组距（lg1.6=0.2），此时上表的范围就缩小。,23,24,2）按预实验求得大概剂量范围后（即10%-90%或0-100%）再按下式求正式试验的组距。i=或i=（n=组数）3）各实验组剂量=最低剂量组的对数值+i，然后再反对数求得。4）一般做LD50，设为5-7组。过多浪费；过少不准确。各组动物数相等：小鼠每组不少于10；大鼠6-8；兔，4-6；各组实验动物雌雄各半，必要时还要分别求雌雄动物的LD50。急性毒性试验中，当高剂量达到5g/kg时，实验动物仍无明显毒性，或虽有毒性体征但无死亡，此时一般可不再求LD50。,25,动物分组的均衡性和随机性,均衡性：要求每组动物的平均体重和体重的离散度尽可能一致，具体来说：每组之间的平均体重相差不应超过10控制均衡性实验动物的体重不应超过全体实验动物平均体重的20控制离散度随机性：每只动物分散到各组去的机会是均等的，以避免成见和系统误差。,26,实验动物的预检,适应性饲养1-3周左右，选择健康的动物。大鼠、小鼠、豚鼠、兔的检疫期为1周犬、猴可适当延长至2-3周设定检疫期的目的让实验动物在本实验室条件下适应一段时间，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响；筛检健康状况等不符合试验要求的动物。,27,三、受试物及处理,受试物的接受、分样、保管、秤重、配制以及在此过程中严格的质量保证影响急性毒性实验的结果。受试物剂型：水溶液、混悬液、油溶液。给药容积的大小，根据染毒途径和实验动物物种来确定。,28,对于各种染毒途径的最大容积，以受试动物的物种或剂量确定。一般规定染毒的最大容积为：,经口：20ml/kg（对空腹动物）；经皮：2ml/kg；（根据体表面积计算，先于染毒的准确性）；静脉注射：1ml/kg（5分钟以上）；肌肉注射：0.5ml/kg（一个部位）；吸入：2mg/L；眼：每眼0.01ml；鼻：猴或狗每鼻孔0.1ml；直肠：0.5ml/kg；阴道：大鼠0.2ml；兔1ml。,29,四、经典急性毒性试验方法,在急性毒性试验以前必须确定染毒方式。一般按照在实际环境中人类的接触方式，可归纳为以下几条：）经口途径）经呼吸道）经皮肤）其它：注射,30,1经口途径（经胃肠道途径）,用于观察：能否经胃肠道吸收及吸收情况吸收速度致死剂量,31,染毒方式：）灌胃）喂饲）吞咽胶囊经口染毒的重要注意事项：“禁食”经口接触，动物应事先禁食，以防止胃内容对化合物毒性的影响。大、小鼠主要在夜间进食，故应隔夜禁食，如预计第二天上午给药，则在凌晨开始就应禁食。家兔、狗等在上午喂食前给予受试物，即可达到空腹的目的。大鼠食入NaCl：禁食时LD50为3.75g/kg；不禁食时LD50为6.14g/kg。禁食期间正常给予饮水，染毒2小时后提供饲料。,32,）灌胃,优点：直接入胃，不与口腔、食管粘膜接触而致吸收。剂量准确。如空腹给予，尚能消除胃内容的影响。缺点：工作量大。长期、多次应用易致食道粘膜损伤。,33,方法,等体积给药：即单位体重所给予的药物（重量或体积mg/kg；ml/kg）应一致。这是因为成年动物的胃容量与体重之间有相关，按单位体重计算灌胃液的体积可使受试物吸收速度相对稳定。一次灌胃体积,34,）喂饲,优点：符合人类接触毒物的实际情况。缺点：受试物如有异味，动物拒食，也存在口腔粘膜吸收的可能性。受试物如有挥发性，可使剂量下降，交叉吸收（呼吸道吸入）。受试物若易水解或与饲料中某些成分发生反应，易影响毒效应。为准确掌握每个动物的实际摄入量则需分笼喂养，还需折算实际摄入量，故较繁琐。一般急性毒性试验不用喂饲法。,35,）吞咽胶囊,优点：剂量准确，尤适用于易挥发、易水解、有异味的化合物。兔、猫、狗等大动物常用此法。缺点：不适用于大、小鼠。,36,2经呼吸道途径,研究外来化合物经呼吸道接触的目的：能否造成呼吸道损伤。能否经呼吸道吸收及其中毒特点。吸收速度。致死剂量（即LD50）。经呼吸道接触外来化合物的方式有二：吸入呼吸道注入,37,1）吸入接触,优点：与实际情况较相符；缺点：吸入成分复杂。,38,1）静式吸入,39,优点：设备简单、操作方便、消耗动物少。目前仍较常用。缺点：接触环境密闭。O2分压下降，CO2分压升高，温度升高，湿度升高。受试物浓度逐渐降低（皮毛、桶壁等的吸附）。有交叉接触（口、呼吸道、皮肤）。接触时间、放置动物数和染毒柜容积均有一定限制。,40,实验动物最低需气量及不同体积染毒柜放置的动物数,注：*按吸入2小时计较大动物一般不使用静式染毒吸入方法，若使用则染毒柜的容积要相应增大。如家兔每小时最低需气量为250L，猴为300L，可依此推算染毒柜的体积。,41,2）动式吸入,指动物置于有空气流动的染毒柜中，此装置有动力部分：能使新鲜空气不断进入，污浊空气不断排出，有不断补充受试物的配气部分。从而使染毒柜内的受试物浓度比较稳定，氧分压恒定、二氧化碳分压恒定。这样可使接触时间不受限制。,42,动式吸入装置如图：,43,动式接触有二种形式：动式吸入接触：有皮肤接触面罩吸入接触：无皮肤接触动式接触的优、缺点：优点：染毒时间可不受限，染毒浓度相对稳定。缺点：消耗受试物多，设备复杂。,44,2）气管内注入,在实验动物麻醉的情况下，将已消毒灭菌的受试物（粉尘旋液或液体）注入气管，使之分布于左右肺内。这种方式多用于制造急性中毒模型，而不常用于急性毒性试验。,45,3经皮肤接触,外来化合物经皮肤接触的机会很多，因而研究化合物经皮肤吸收的毒性特征、吸收速度和致死剂量以及能否引起皮肤损伤具有很重要的意义。皮肤是多层结构，外来化合物只有穿透角质层达到真皮才能吸收入血。因此研究经皮肤吸收是指对完整皮肤而言。,46,经皮肤吸收有四种结局：不穿透、不损伤；或少量吸收，但很快降解，无中毒反应出现。经皮肤吸收导致中毒，最终死亡。局部刺激或损伤，不伴有全身中毒。皮肤过敏、光敏反应。,47,经皮肤吸收研究,动物：皮肤解剖、生理特征与人相近的小型猪、家兔或豚鼠。考虑到经济因素，可用大鼠。定性试验浸尾试验：一般大鼠尾部浸两小时。兔耳法：观察双侧兔耳变化。定量试验实验目的：在试验动物脱毛部位定量涂布受试化合物，以求出经皮接触的剂量-反应关系。,48,脱毛方法：化学法：脱毛剂硫化钡滑石粉:硫化钠淀粉:机械法：剪剃去毛脱毛部位：兔、豚鼠背部中线两侧大鼠背部中央或腹部脱毛面积：体表面积的10-15%体表面积=10.4W0.667(W指体重)脱毛后必须观察24小时，确认无皮肤损伤后才能进行实验。实验方法：可用玻璃钟罩，接触受试物26小时，接触剂量以mg/kg或mg/cm2表示。,49,局部作用研究,局部作用的研究可以通过皮肤吸收试验一起观察，也可以单独进行。局部作用研究结合经皮吸收实验进行：在取下玻璃钟罩以后，观察中毒反应和经皮吸收试验一起进行。但因经皮吸收毒性试验所用剂量大，有时尚未取下玻璃钟罩动物就有可能死亡，因此有时不能观察到完整的局部损伤的变化。,50,单独设计局部作用研究斑帖法在脱毛区（1cm2），帖敷浸有受试物的多层纱布，剂量小于致死剂量，再盖上油纸或塑料布，贴牢并固定，12-24小时解开，观察皮肤反应。,51,红斑、焦痂评分标准,以水肿过程为评分标准,皮肤反应评分表,52,由于皮肤局部刺激损伤往往发展过程缓慢，一般评价24小时反应或72小时反应，取其平均值，此称为“原发性刺激指数”。指数2分轻度刺激指数2-5分之间中等刺激指数6分重度刺激,53,4注射途径接触,是研究外来化合物毒性作用的特殊方式，一般仅用于几种化合物毒性的比较，毒物的代谢、毒动学或药物的研究。静脉注射；皮下注射；腹腔注射；肌肉注射等。,54,吸收速率比较,静脉注射吸入肌肉注射腹腔注射皮下注射经口皮内注射经皮,55,五、急性毒性替代试验,固定剂量法急性毒性分级法上下移动法,56,1、固定剂量法,不以动物死亡为观察终点，预先选定的或固定的一系列剂量染毒，如5、50、500mg/kg，最高限量是2000mg/kg。观察毒性反应，对化学物毒性进行分级。EEC的急性经口毒性分级标准为：高毒(LD502000mg/kg)平均用大鼠14.8只，经典方法平均用大鼠24.2只。,57,2、急性毒性分级法,以死亡为终点的分阶段试验法，每阶段3只动物，平均经24阶段，根据死亡动物数，判断急性毒性。首选大鼠，从25、200、2000mg/kg体重3个固定剂量中选择一个剂量开始试验，根据结果判断：不需要进一步试验进行分级；下一阶段以相同剂量的另一种性别试验；下一阶段以较高或较低的剂量水平进行（从200mg/kg体重开始）。动物观察14天，染毒当天观察体征和死亡至少两次，之后每日观察一次。每周测体重，所有动物进行大体解剖，必要时进行组织病理学检查。,58,3、上下移动法（阶梯法）,以死亡为终点，也可用于观察不同的终点。根据初步资料确定第一只动物接受化学物的剂量，由第一只动物染毒后的反应决定第二只动物的接受剂量，如死亡则下一个剂量降低，如存活则下一个剂量增高。该方法需要选择一个比较合适的剂量范围，使得大部分动物的所接受的化学物剂量在真正的平均致死剂量左右。方法改进后，仅需要69只动物。,59,六、毒性作用观察,1）观察时间：一般要求的观察时间为14天。许多化合物在动物接触后很快死亡，如有机磷、氰化物等。但是有的化合物所致的中毒症状发展迟缓，可出现迟发性死亡。如：羰基镍为高毒化合物，动物吸入后，开始仅表现为轻度的刺激症状，但接触2-3天以后，可出现明显的中毒症状，并开始陆续死亡。另外，动物个体差异的存在，死亡时间也不同。如小鼠腹腔注射过氧化二碳酸二环己酯（DCPD），同一组动物，最早死亡时间为注入后7小时，最迟为150小时（6天）。,60,观察时间可随具体情况设为24小时，3天，7天等。观察时间过长，如超过14天时，有时不能区分动物是由于中毒死亡，还是因其它原因所致，因而也无必要。值得注意的是：任何LD50或相关参数测定，均应标明接触时间。,61,2）症状观察,目的：是观察外来化合物急性毒性的重要环节，同时可以弥补LD50参数的不足。内容：中毒的发生、发展、规律；体重改变、死亡前症状、特点，死亡时间等。,62,啮齿类动物化合物中毒主要观察内容,63,有的化学物能够使动物很快出现兴奋症状，如含有氨基的氰氢酸和丙烯腈对大、小鼠染毒后，都很快出现兴奋。有的化学物给动物染毒后，动物先出现抑制现象，直至死亡。例如：N-苯甲酰基-N-（3,4-二氯苯基）-2-氨基-丙酸乙酯，给大、小鼠灌胃致死剂量，动物很快表现为闭目静卧、四肢无力、站立不稳、步态蹒跚、呼吸减慢，最后缺氧、口鼻青紫死亡。有的化学物给予动物后，动物先出现刺激症状，如羰基镍吸入染毒在大、小鼠先出现前肢反复搔鼻等呼吸道刺激症状。,64,有些化学物结构相似，但毒性表现也有差别。含有氨基的氰氢酸和丙烯腈对大、小鼠染毒后，都很快出现兴奋。染毒丙烯腈的动物首先出现活动增加、骚动、窜跑、甚至跳跃，之后出现呼吸困难，耳与尾青紫色；而氰氢酸呈一过性兴奋，呼吸加快、加深，然后呼吸困难，耳与尾则为桃红色。可见同为氰化物，其中毒表现和机制有所不同。,65,在观察期内还需多次测量动物体重，体重改变可以反映动物染毒后的整体变化。实验动物染毒后的死亡时间也应记录、分析，有时死亡时间的分析可以提供一些重要信息。例如：久效磷小鼠经口与腹腔注射染毒，均呈现随染毒剂量增加，死亡时间缩短；死亡时间与染毒剂量之间可呈直线负相关，提示实验动物致死是可能由于化学物原形所致。而过氧化二磷酸二环己酯（DCPD）给大鼠腹腔注射后，染毒剂量对数值与死亡时间呈明显负相关，但给小鼠腹腔注射后，则无明显相关。可能是与该化学物在大鼠和小鼠体内代谢不同有关。,66,3）病理和其它指标观察,对死亡的动物应及时做大体解剖检查，观察内脏器官有无出血、坏死等，对有变化的器官应进行病理组织学检查。如果有阳性发现，应以此为线索，进行下一步研究。为之后的亚慢性、慢性毒性试验提供参考观察指标。,67,第二节急性毒性试验程序与急性毒性评价,68,一、急性毒性试验程序,1.受试物资料的采集：化学结构式、分子量、理化性质、生产批号、纯度、成分含量等。或查阅文献搜集与之相近的化学物毒性资料。2.实验室的要求：GLP。3.实验动物的要求。4.试验剂量的分组。5.中毒表现的观察，相关参数的计算。,69,二、半数致死量与急性毒作用带,LD50（LC50）应用中需注意的问题:1927年Trevan引入了半数致死量LD50（LC50）的概念来评价急性毒性，此后该指标得到广泛应用，并成为急性毒性的主要指标。,70,LD50的波动性:LD50（LC50）是一个统计量，它受到许多因素的影响，包括实验动物的物种、品系、性别、年龄、受试化合物的浓度、稀释溶液的性质、喂养条件以及试验者的熟练程度等。因此，在比较不同实验室的LD50时要考虑到各种影响因素的存在，以及实验条件的等同性。另外，即使各个条件都相同，但由于实验动物的抽样误差，LD50的差别依然存在。,71,同一毒物不同实验室LD50测定结果的差异,72,1977年欧洲共同体组织了13个国家的11个实验室，统一主要的实验条件对5种化学物的LD50进行测定。根据收集到的80个实验结果分析，结果仍存在相当大的差别，可达2.448.38倍。,73,74,LD50（LC50）的局限性:LD50（LC50）虽然是一个重要的急性毒性参数，但它只能表示一种外来化合物引起实验动物死亡一半的剂量(或浓度)，即一半死亡、一半存活的剂量界限，所以它是一个质反应。LD50（LC50）给予有效信息较少，实用性有限，有其局限性。表现在它不能反映急性毒性作用的特征，也不能反映其毒作用带的宽或窄。因此，为弥补LD50（LC50）的不足，实验中还要详细描述实验动物的中毒特征，并选择其它的参数，如急性毒作用带。,75,急性毒作用带,急性毒作用带（acuteeffectzone，Zac），即化合物急性毒性的上限与下限的比值，通常急性毒作用带中，死亡剂量用LD50表示，最低作用剂量采用急性阈剂量（阈浓度）(Limac)表示:Zac=Zac反映了化学物质从产生轻微损害到导致急性死亡的剂量范围宽窄，Zac大，表示Limac与LD50的距离大，发生急性死亡的危险性较小。反之，危险性就大。,76,三、毒性分级,为了大致表示外来化合物的急性毒性强弱及其对人的潜在危害程度，国际上提出了外来化合物的急性毒性分级（acutetoxicityclassification）。但分级的标准尚不统一。我国除参照国际上的几种分级标准外，也提出了相应的暂行标准，但不管是国际、国内，制定的标准都存在不少的缺点和不足，尚有待改进。,77,工业毒物急性毒性分级标准(1978),78,化合物经口急性毒性分级标准,79,外来化合物急性毒性分级(WHO),80,农药的急性毒性分级标准(1991),81,第三节局部刺激试验,原发性眼刺激试验eyeprimaryirritationtest皮肤原发性刺激试验skinprimaryirritationtest皮肤致敏试验skinsensitization,allergiccontactdermatitis,82,一、原发性眼刺激试验,观察终点眼刺激性（eyeirritation）：眼睛前表面接触受试物后产生的眼睛可逆性炎症变化。眼腐蚀性（eyecorrosion）：眼睛前表面接触受试物后产生的眼睛不可逆性组织损伤。Draize试验：家兔4只，观察7天，必要时可延长至21天结膜：发红，球结膜水肿和分泌物角膜：浑浊程度和范围虹膜：充血、肿胀和角膜周围充血一般情况，家兔出现的刺激反应大于人的反应。,83,一般强酸强碱性物质可以免做眼刺激试验。pH接近中性的大部分化学物质，对皮肤和眼的刺激性反应结果不一定有关系，必需独立进行眼刺激实验。,84,二、皮肤原发性刺激试验,观察终点皮肤刺激（dermalirritation）：皮肤接触化学物后产生的局部可逆性炎症变化。皮肤腐蚀（dermalcorrosion）：皮肤接触化学物后产