Topic 1 毒理学方法技术

环境毒理学的研究方法与技术,主讲人：吴玲玲,什么是环境毒理学环境毒理学是主要研究环境污染物，特别是外源性环境污染物对生物有机体，尤其是人体的影响及其作用机制。,生物分子细胞器细胞组织器官个体,各级生物学水平,个体水平：发光细菌检测法发光细菌是一种非致病的革兰氏阴性兼性厌氧细菌。发光细菌在正常的生理条件下能发出波长在450490nm的蓝绿色可见光。当发光细菌接触有毒污染物时，细菌新陈代谢则受到影响，发光强度减弱或熄灭，发光细菌发光强度变化可用发光检测仪测定。在一定浓度范围内，有毒物浓度大小与发光细菌光强度变化成一定比例关系。因此可通过发光细菌来监测环境中的有毒污染物和水体的环境质量。,上世纪70年代至80年代初，国外科学家首次从海鱼体表分离和筛选出对人体无害，对环境敏感的发光细菌，用于检测水体生物毒性，现已成为一种简单、快速的生物毒性检测手段。,发光细菌检测法以采集的原水浓度为最高浓度，水体的毒性用EC50表示，即发光细菌发光强度降低50时对应的浓度。其检测结果可与标准毒性物HgCl2或苯酚对照得出相应的毒性当量。优点：对很多毒物较为敏感；重复性好；能准确测定水中2000多种有害物质。目前国内常用的3种发光细菌为：明亮发光杆菌、费氏弧菌、青海弧菌Q67。,发光细菌检测法明亮发光杆菌在GB/T15441-1995水质急性毒性的测定发光细菌法中所使用；费氏弧菌在欧盟的标准中所使用；青海弧菌是在青海湖的鱼体内提取的菌种，属淡水菌，在测试饮用水时有较大优势。20世纪80年代初美国Beckman公司推出功能完备的生物毒性测试仪，它具有应用范围广，灵敏度高，相关性好，反应速度快等优点。,预处理：过滤、紫外灭菌、pH（5-8）受试生物：指数生长期的浮萍测定指标：7天内叶子数量、叶面积、叶绿素含量和干重的抑制率,浮萍（Lemnaminor）生长抑制试验（ISO20079）,水样采集后24h之内。受试生物：实验室条件下培养3代以上、出生6-24h的幼蚤。试验温度：18-22，光照：自然光照，或者光暗比为16：8。测定指标：半数运动受抑制浓度（24hEC50、48hEC50）和半数致死浓度（24hLC50、48hLC50）。轻轻摇动试验容器,若15s内大型蚤不能运动,认为其运动能力受到抑制。,溞类活动抑制试验：大型水溞毒性试验,（1）斑马鱼生长周期短,斑马鱼（Dariorerio）胚胎发育毒性测试,（2）鱼卵易于收集和观察,（3）斑马鱼的胚胎发育迅速且同步发育,斑马鱼胚胎发育毒性测试的方法,收集胚胎,镜检,染毒,10,10,11,卵裂期（0.75-2h）：受精卵开始分裂,通常是毒性试验的开始染毒阶段,斑马鱼胚胎发育过程及毒理学终点,12,囊胚期(2-5h),细胞分裂速度加快，细胞数目指数增长,4h时观察：卵凝结（致死）,正常,受毒,13,原肠胚期(5-10h),分裂细胞向植物极延伸，逐渐包裹住卵黄囊,8h观察：卵凝结（致死）不开始原肠胚作用（致死）,正常,受毒,14,分裂期：(10-24h),鱼的雏形可见躯干，肌节、眼点、耳石逐渐形成，尾部延展,24h时观察：无肌节形成（致死）眼点、耳石不发育尾部无延展（致死）20s内主动活动水肿,正常,受毒,菲暴露导致24h尾部不延展,15,成形期：(24-48h),心脏、血液循环逐渐形成；黑色素沉积，血色素形成,48h时观察：无心跳（致死）心率显著变化无或少黑色素沉积水肿,正常,受毒,水肿,二噁英减慢斑马鱼胚胎和幼鱼心率。多环芳香烃类暴露出现心包囊水肿和多种畸形。,16,孵化期：(48-72h),破绒毛膜，孵化出仔鱼,72h时观察：孵化率畸形孵化延迟水肿,正常,受毒,PFOA和PFOS暴露导致孵化延迟。硫化物暴露导致脊柱弯曲，菲暴露导致尾部发育不全和水肿。,17,不同类型的毒理学指标,组织水平石蜡切片：组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。石蜡切片法是将组织经过一系列药品处理，使石蜡渗入组织，包埋成蜡块，再把组织蜡块切成极薄的片子，根据不同的需要用不用的染色方法以显示不同细胞和组织的形态。,步骤：取材、固定、脱水和透明、浸蜡、包埋、切片、摊片、烘片、脱蜡、水化、染片、封片。取材：组织块大小一般为0.50.50.2cm，110.3cm。,Gills,Kidney,Liver,intestines,固定：用适当的化学药液固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。一般组织以10%福尔马林溶液固定24-48h左右，或Bouin氏液（苦味酸+福尔马林+冰醋酸）固定12-24h。,脱水：标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，必须将组织块内的水分置换出来，这一过程叫做脱水。常用的脱水剂为一系列不同浓度的乙醇。脱水的步骤是：80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇2小时，此过程可用脱水机自控完成。透明：为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，而达到石蜡浸入组织块的目的。常用的溶剂为二甲苯。,浸蜡：组织透明后，放入融化的石蜡内浸蜡，使石蜡渗入组织同时取代组织内的二甲苯，这个过程为浸蜡。包埋：将浸蜡后的组织材料放蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固，即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块，此过程称为包埋。,切片：组织经石蜡包埋后制成蜡块，用切片机切成薄片的过程成为切片。切片机的厚度调节器上刻有050m或025m，可任意选择其厚度，石蜡切片的厚度一般在46m。,摊片：用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在4045的水面上，借水的张力和水的温度，将略皱的蜡带自然展平。在载玻片上滴一两滴蒸馏水，将蜡带平铺到水滴上，吸水纸吸去多余水分。烘片：40烘一天。,脱蜡及水化：干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。,染色和封片：常用的染色方法是苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin）染色法，简称H.E染色法。这种方法对任何固定液固定的组织和应用各种包埋法的切片均可使用。染色结果细胞核蓝色，细胞液、肌肉、结缔组织、红细胞等呈现不同程度的红色。,细胞水平急性细胞毒性：eg.细胞对中性红吸收试验原理：中性红可以被活细胞所摄入，并在溶酶体中积累。在细胞增殖加快时，细胞数量增多，可以摄入的中性红的量就会增加。在细胞受到损伤时，中性红的摄入能力会下降。这样通过对于中性红摄入量的不同就可以确定细胞的增殖或毒性情况。,细胞水平方法：不同浓度梯度的毒性溶液+细胞于20CO2培养箱中孵育48h后，细胞在中性红溶液中孵育3h。于540nm处检测剩余中性红含量，690nm为参考波长。计算NR50即有毒物质使细胞的中性红吸附减少50%的浓度。,分子水平体外模拟是近年来研究分子毒性较常用的一类方法。是指在模拟机体环境中将有毒污染物与生物大分子相互作用，并结合一系列的物理、化学和生物检测方法取得二者相互作用的参数，从而分析作用机理。目前研究有毒小分子物质与生物大分子之间的结合作用主要手段有光谱法（紫外可见光谱、荧光光谱、圆二色谱法等）、平衡透析法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、质谱法等。,荧光色谱法广泛应用于污染物与蛋白质、DNA等生物大分子的相互作用表征，它是利用色氨酸残基具有荧光性的特点，在外源污染物进入机体后可能会与蛋白质氨基酸残基结合形成不发光的稳定复合物（静态淬灭），或者由于碰撞作用导致荧光性短暂性消失（动态猝灭），通过测定荧光强度和荧光寿命来确定不发光的原因，进一步探讨两者直接的结合模式。,平衡透析法利用半透膜的选择通透性，可以成功有效的将自由态小分子物质和结合态物质进行分离，是定量研究生物大分子与有机小分子相互作用的经典方法。通过平衡透析法的研究可以探讨生物大分子与有机小分子的结合数目、平衡常数等。,圆二色谱法（CD）CD对溶液中蛋白质的立体结构变化高度敏感，通过圆二色谱图能检测其立体化学结构的微小变化，并且计算出-螺旋、-折叠等二级结构空间构象的具体变化数，从而判断蛋白质的二级结构是否受到影响而发生变化。CD技术在有机物与血清蛋白、DNA等相互作用的研究领域得到越来越广泛的应用。,组学技术基因组学技术基因组(Genome)是指生物的全部基因和染色体组成。基因组学(Genomics)于1996年由Roderick提出，指对所有基因进行基因组作图(遗传连锁图谱、物理图谱、转录本图谱)、核苷酸序列分析、基因定位和功能分析的一门学科。基因组包括高通量表达分析方法如基因表达序列分析(SAGE)，DNA芯片(DNAchip)等。,蛋白组学技术通常情况下，生物的基因组只表达少部分基因，而且表达的基因类型及表达程度随生物生存环境、内在状态的不同而表现出极大的差异，且此差异具有严格调控的时空特异性。一套基因组中的基因，由于外界条件不同，可以表达出多套不同的多态性和多效性蛋白，因此必须研究生命活动的执行体蛋白质这一重要环节。蛋白组(Proteome)是指一个基因组、一种细胞/组织或一种生物所表达的全套蛋白质。大规模蛋白组学分析过程包括样品制备、图像分析、蛋白质成分的分析与鉴定。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白组学研究的三大基本支撑技术。,对照,0.05gL-1,100.0gL-1,案例分析1.菲对斑马鱼肝、鳃组织的毒性,a.示肝细胞肿大（箭）、细胞核变形（箭头）与细胞空泡化（星号）b.示肝细胞核萎缩（箭头）与细胞空泡化（星号）加重，局部肝组织坏死（箭）。,菲暴露下斑马鱼鳃组织结构的变化,对照,0.05gL-1,100.0gL-1,示泌氯细胞（CC），扁平细胞（PVC），柱细胞（PiC），血管道（B）;a.示鳃小片上皮细胞肥大和水肿（箭头）；b.示鳃小片上皮细胞水肿（箭头）与隆起（星号）。,案例分析2.应用斑马鱼胚胎评价长江口沉积物的污染水平,表层沉积物中重金属的含量（gg-1）,长江口表层沉积物中的化学分析结果,根据加拿大和美国佛罗里达洲的海洋和河口沉积物的化学品风险评价标准ERL：生态风险评价低值。ERM：生态风险评价的高值。,表层沉积物中的典型有机污染物的含量（ngg-1）,沉积物对胚胎存活