血栓与止血的筛选试验及其临床应用ppt课件

.,血栓与止血的筛选试验及其临床应用,上海交通大学医学院附属瑞金医院王鸿利王学锋,.,迄今，检测血栓与止血的试验逾百种，大致可分为筛选试验、确诊试验、排除试验和基因分析等四大类。本文仅就筛选实验，如出血时间（BT）、血小板计数（PLT），活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT），纤维蛋白（原）降解产物（FDPs）、D-二聚体（D-D），血小板功能分析仪（PFA-100）、血栓弹力图（TEG）的检测其临床应用作一简述。,.,图1血管内皮细胞与止血系统,.,（一）一期出血缺陷筛检试验的应用,1.一期止血缺陷是指血管壁和血小板异常所引起的止血功能缺陷，主要是由于毛细血管壁通透性、脆性增加或血小板数量、质量异常所致的出血。,.,2.临床特点出血以皮肤、黏膜为主，重者可伴有内脏出血；但肌肉、关节等组织出血罕见。对压迫、缝合、外用止血剂或输注血小板治疗有效，但对血浆和血浆凝血因子制品无效。3.筛选试验出血时间（BT）血小板计数（PLT）,.,筛选试验1.出血时间（BT，模板式刀片法/出血时间测定器法）反映毛细血管壁与血小板相互作用：毛细血管的完整性、收缩性以及血小板数量、功能的实验。参考范围：TBT法：6.92.1min,.,临床意义：BT延长（9.0min）（1）PLT与BT呈负相关，PLT愈BT愈。（2）血小板功能异常：血小板无力症、巨血小板综合征、灰色血小板综合征等。（3）部分凝血因子缺乏：低/无纤维蛋白原血症、血管性血友病（vWD）等。（4）遗传性出血性毛细血管扩张症。（5）药物：阿司匹林（ASA）、氯吡格雷（玻立维）和阿昔单抗等。,.,方法学评价上海瑞金医院对126例ITP和20例vWD患者检测BT结果列于表1；对BT的三种方法比较见表2。表1ITP和vWD应用两种BT法检测的结果,*P0.01,.,表2三种BT检测方法的比较,.,2.血小板计数（PLT）单位容积的循环血液中所含血小板的数量（109/L）。方法：（1）直接血小板计数法（普通显微镜法/相差显微镜法）；（2）血液分析仪（电阻抗法/光散射法）；（3）流式细胞仪法。参考范围：国内：85320109/L（成人）；通常是100300109/L。,.,临床意义（1）血小板减少（100109/L）：PLT50109/L，出血少见；5030109/L，外伤性出血；20109/L，自发性出血，常需输注血小板制品。血小板减少原因：生成减少、破坏增多、消耗过多、分布异常等。（2）血小板增多（400109/L）：PLT400600109/L，需观察；PLT600109/L，需治疗；PLT600109/L，需血小板分离。血小板增多原因：骨髓增生性疾病、反应性血小板增多。,.,方法学评价ICSH推荐：一般用血涂片法观察血小板分布并与计数核实。（1）草酸胺稀释-相差显微镜计数血小板；（2）流式细胞术计数。经国际11个实验室用CD41、CD61验证，该法准确度、精密度很好，可作为自动血细胞分析仪的校准和PLT减少的准确性的验证。,.,图2一期止血缺陷的筛选试验,.,图3先天性初期止血异常的实验室检查,.,获得性初期止血异常的实验室检查,.,（二）二期止血缺陷筛检试验的应用,1.二期止血缺陷是指凝血障碍和抗凝物质所引起的止血功能缺陷，主要是由于凝血因子缺乏或体内产生病理性抗凝物质所致出血。,.,2.临床特点出血以肌肉、关节为特点、也可有内脏、皮肤出血对血浆、血浆凝血因子制品有效，但对压迫、外用止血剂和输血小板疗效欠佳。3.筛选试验活化部分凝血活酶时间（APTT）血浆凝血酶原时间（PT）,.,图4凝血系统及其筛选实验,.,1.活化的部分凝血活酶时间（APTT）APTT是内源凝血途径的常用和较敏感的筛选试验。参考范围：传统的是3143s；目前随着仪器和试剂的开发，其参考值不一，尚难统一。正常对照值：传统的须测对照值，以测定值较对照值延长10s为异常；目前也未统一。APTTR：患者APTT/正常对照APTT比值，尚未得出参考范围，尚未推广应用。,.,临床意义（1）内源性凝血途径因子缺陷：F（血友病A）、F（血友病B）、F、F、PK和HMWK等遗传性缺乏症。（2）内源性凝血途径因子抑制物存在：常见F、F抑制物，狼疮抗凝物（LA），应选用鞣花酸为激活剂更敏感。（3）药物所致异常：常见肝素（患者APTT/正常人APTT比值为1.52.5为治疗范围）、输注库血引起凝血病等。（4）纤溶活性增强：尤其是多见于继发性纤溶亢进（DIC），而原发性纤溶很少延长。,.,方法学评价（1）激活剂：白陶土、硅藻土和鞣花酸的敏感性比较，见表3表3不同激活剂对APTT敏感度比较,.,（2）凝血时间检测的敏感性比较：瑞金医院对血友病患者凝血时间的敏感度作比较,延长率（%）：APTT95%，硅管法CT100%，ACT100%，而试管法CT为70%，故目前用APTT为筛选实验简单、方便、实用。,.,2、血浆凝血酶原时间（PT）PT是外源凝血系统常用和较为敏感的筛选实验。参考范围：传统法为121s（1113s）；目前，随着仪器和试剂不同，参考范围也有不同。尚未统一。正常对照组：传统法为测定值较正常对照组3s为异常，目前也未统一。PTR参考范围：1.000.05，已在应用。,.,临床意义（1）PT延长：见于遗传性/获得性外源凝血系统的凝血因子缺乏；获得性常见于DIC、依K因子缺乏、口服抗凝剂、肝病；循环血抗凝物质：肝素、FDP、抗因子抗体。（2）PT-INR多用于监测口服抗凝剂（华法林）。INR1.5提示抗凝剂无效；INR1.52.0用于预防；INR2.02.5常规抗凝；INR2.53.0重度抗凝；INR3.0易致出血。,.,方法学评价（1）Hct30%或50%，抗凝剂和血液的比例应按下式调整（表4）抗凝剂量（mL）=（100-Hct）血液量（mL）0.00185表4Hct对PT和APTT测定结果的影响,.,（2）凝血活酶（组织因子）：兔脑、人脑、重组组织因子（rTF）对PT的结果，不尽相同。rTF人脑兔脑（3）缓冲剂其维持血浆pH，防止易变因子失活；如果无缓冲剂，血浆pH增加，PT延长。,.,（三）、筛选试验的联合应用,主要是PT、APTT和PLT的联合应用。,.,1）PT（N）、APTT和PLT（N）,.,2）PT（）、APTT（N）和PLT（N）,.,3）PT（）、APTT（）和PLT（N）,.,4）PT（）、APTT（）和PLT（）,.,5）PT（N）、APTT（N）和PLT（）,.,6）有出血症状，但PT（N），APTT（N）和PLT（N）,.,图3先天性凝血异常的实验室检查,.,表获得性凝血性障碍项目的选择和应用,.,（四）纤溶活性增强筛选试验的应用,1、原发性纤溶性增强指组织型纤溶酶原激活物（t-PA）或尿激酶型纤溶酶原活物（u-PA）的活性增强所致纤溶性亢进2、继发性纤溶活性增强几乎都见于DIC，是指因子a激活激肽释放酶原（PK）生成激肽释放酶（KK），KK激活纤溶系统所致纤溶活性增强。,.,3、筛选试验纤维蛋白（原）降解产物（FDP）测定D-二聚体测定（D-D）,.,图5FDP和D-D的生成,.,1、纤维蛋白原（Fg）和纤维蛋白（Fb）降解产物（FDPs）测定指纤溶酶同时降解Fg和Fb产生的FDPs。（1）定性试验：胶乳凝集法。阴性：血清FDP含量10g/mL，血浆FDP含量5g/mL，尿液FDP含量2g/mL。阳性：血清FDP含量10g/mL，血浆FDP含量5g/mL，尿液FDP含量2g/mL。,.,（2）定量试验：ELISA法。包被于固相的FDP抗体与样本中FDP（抗原）结合，加入酶标抗体后形成夹心复合物，呈显色反应。参考值：5g/mL。,.,2、D-二聚体（D-D）测定指纤溶酶特异性降解纤维蛋白（Fb）所产生的降解产物。（1）定性试验：胶乳凝集试验。阴性：无凝集颗粒者，即D-D含量0.5g/mL阳性：有凝集颗粒者，即D-D含量0.5g/mL半定量：以0.5g/mL、0.5g/mL阳性时的最大稀释倍数。,.,（2）定量试验：ELISA法。参考范围：0.5g/mL（3）定量试验：胶体金法。将血浆加入检测卡孔内，血浆中D-D吸附于包被有D-D单抗膜中，再加入D-D单抗-胶体金耦联物溶液，膜中D-D将与金标抗体发生结合反应，用光笔阅读仪读数。参考范围：0.3mg/L,.,临床应用（1）纤溶活性增强筛检试验的应用FDP正常，D-D正常：多数为正常人，提示无纤溶过度现象。FDP阳性，D-D正常：多数为FDP的假阳性或原发性纤溶症。FDP正常，D-D阳性：多数为FDP假阴性或继发性纤溶症。FDP阳性，D-D阳性：多数为继发性纤溶症，常见于DIC。,.,（2）在诊断DIC中的应用见表5表5FDP和D-D在诊断DIC中的应用,.,(3)D-D在排除静脉血栓（VTE）中的应用D-D测定在排除VTE中有重要价值（表6）。表6D-D测定在排除VTE中的应用,.,方法学评价（1）对VTE的诊断：D-D测定有高度敏感性和阴性预测值，但特异性较低。因此，D-D测定阴性可排除VTE，阳性不一定是VTE。（2）D-D测定，WHO规定用ELISA法，临界值为500g/L。因此D-D测定值500g/L排除VTE，几乎为100%，500g/L诊断VTE的可能性为40%，必须结合其他影象检查。,.,（3）D-D测定阴性时，结合临床低/中危险度，其排除价值更大；D-D测定阳性时，结合临床高危险度和影象检查诊断价值更大。（4）FDP和D-D阳性可见于老年人、妊娠、癌肿、DIC、肝病、感染、炎症、创伤、手术、溶栓治疗、冠心病等。判断结果时要充分考虑。,.,（五）DIC筛选试验的应用,诊断DIC必须符合下列4项：（1）引起DIC的基础疾病：病因诊断（2）有DIC的临床表现：临床诊断（3）DIC的实验室检查：实验诊断（4）对肝素治疗有效：治疗诊断,.,临床应用1、国外DIC的记分诊断标准（表9）,.,2、国外DIC的记分诊断标准（表10）,.,3、日本厚生省DIC诊断记分标准表11,注：计分7分确诊DIC，计分6可疑DIC，5则可能性少，可疑时补做：Sfmc、DD、TAT、PAP，动态plt，抗凝治疗有效,.,4、国内基层单位DIC诊断标准（1999）对临床怀疑，有下列7项中3项即可诊断DIC（1）PLT50109/L或进行性（2）Fg1.5g/L或4.0g/L，且呈进行性变化（3）3P试验（+）或FDP20mg/L（4）PT缩短/延长3s，或呈动态变化（5）外周血涂片破碎红细胞10%（6）ESR15mm/h（7）血凝块在2h内出现溶解现象,.,方法学评价1、DIC常用实验指标的评价（表7）,.,2、DIC联合实验指标分析（表8）,.,方法学评价见表7、表8。我院对864例DIC患者进行统计，它们的敏感性、特异性和诊断准确率分别为60%、66%和63%；对DIC前期109例患者的敏感性、特异性和诊断准确率分别为80%、68%和74%。Wada等（2003）DIC的诊断标准作了前瞻性评价，结果显示：敏感性为91%，特异性为97%。由此可见，所用DIC实验诊断指标，基本上可以满足临床需求。,.,（六）自动化仪器在血栓与止血筛选试验中的应用,1、血栓弹力图（thrombelastograph，TEG）承载全血标本的测试杯以445左右摆动，当杯中凝血启动，置于杯中的金属针受到凝血块生成/溶解的切应力作用，随之一起摆动。金属针在摆动过程中所产生的电流，经电脑软件处理后，便形成曲线。这种仪器称血栓弹力仪，所形成的曲线称血栓弹力图（TEG）,.,图6TEG各参数的形成,.,表12TEG主要参数及其含量,.,.,临床应用,（1）判断凝血状态：低凝、高凝状态低凝状态：R、K值都延长高凝状态：R、K值都缩短指导血浆制品的选择（2）判断肝素/LMWH疗效：有效、过量、抵抗普通检测R、K值=肝素R、K值，示无肝素存在普通检测R、K值肝素R、K值，示有肝素存在指导肝素/LMWH使用和鱼精蛋白中和,.,（3）判断抗血小板治疗：有效、过量、抵抗用TEG的血小板定位图（plateletmapping）。使用抗血小板药后血小板抑制率20%为抵抗。使用抗血小板药后血小板抑制率50%75%为有效。（4）评估非心脏手术后血栓事件的发生率应该维持MA值67mm将大大降低血栓事件若MA值6772mm，血栓发生率为16%。若MA值7295mm，血栓发生率为32%。,.,（5）评估PCI后血栓事件的发生机率若PCI后，MA值6568mm，发生率为10%。若PCI后，MA值6872mm，发生率为14%。若PCI后，MA值72mm，发生率为60%。（6）其他应用区别原发性纤溶和继发性纤溶（DIC）判断高凝状态原因：凝血亢进、血小板活性鉴别手术出血：外科出血、内科出血,.,2.血小板功能分析仪（plateletfunctionanalyzer-100,PFA-100)体外筛选血小板黏附和聚集的仪器。以标有胶原/腺上腺素（CEPI）和胶原/ADP（CADP）两种纤维膜为诱导剂，以观察膜孔闭合时间（closuretime，CT）为结果。参考范围CEPI为61203s；CADP：48187s,.,InVivoHaemostasis,PFA100.avi,capillary200m,aperture150m,epinephrin