PCR仪器的使用及注意事项

实时荧光定量PCR仪使用,PCR原理:,PCR（聚合酶链式反应）:是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析,PCR工作过程：,PCR仪器,BIO-RADCFX96,ABI7500,QuantStudio3,line9620,定量标准曲线（Quantitation-StandardCurve)相对定量标准曲线（Quantitation-RelativeStandardCurve)定量CT比较法（Quantitation-ComparativeCtCt）溶解曲线（MeltCurve)基因分型（Genotyping）定性实验（Presence/Absence),实验类型:,绝对定量&相对定量：绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数.相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数.绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品,必须做标准曲线.相对定量可以做标准曲线,也可以不做标准曲线.,AB7500绝对定量,1、双击桌面图标，或从StartAllProgramsAppliedBiosystems7500Software7500V2.0开启软件。进入主界面后选择AdvancedSetup。2.默认进入Setup下的ExperimentProperties界面2.1输入实验名称（ExperimentName）,2.2确认仪器型号2.3在实验类型中，选择Quantitation-StandardCurve2.4选择试剂种类2.5确认运行模式,TaqMan探针法（寡核苷酸探针）：5端荧光报告基团与靶基因特异性结合的序列3端淬灭基团完整的探针：检测不到报告荧光切断的探针：检测到报告荧光5-3外切酶活性将探针酶切降解水解探针，使报告基团和淬灭基团分离,淬灭基团,报告基团,3.进入Setup下的PlateSetup界面，编辑基因（Target）及样本（Sample）,3.1在界面中设置基因及样品，添加新的基因，并在Targetname编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团；利用添加新的样本，并编辑样品名称。,3.2在界面中进行样品板的排布分配S:标准曲线数据点，U:未知样本，N:阴性对照勾选基因勾选样本名称3.3设置标准曲线：利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔（一般情况下，每个梯度设置三个副孔），而后勾选左侧的基因，在Task选项中选择S，在Quantity中输入拷贝数。按照相同操作，完成标准曲线其他数据点的设置（建议5个梯度）。,标准曲线:标准品目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系标准曲线的制备:至少5个点的10倍标准曲线10倍连续梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v,4.在Setup下的RunMethod界面中，设定反应条件。,5、点击文件储存成ExperimentDocumentSingleFiles（*.eds）格式，然后在按下按钮，反应即开始进行。,6、实验结束后，点击界面右上角的Analyze按钮，软件将会显示实验结果：,7、查看标准曲线时，可通过更改PlotSettings来改变标准曲线的显示方式。Eff%代表扩增效率(Eff%：90%110%）。R2值代表标准曲线的数据点与回归曲线的接近程度，0.99,8、对于SYBRGreen法实验，可以在MeltCurve界面中查看熔解曲线。,9、检测QCSummary结果，可以快速查看实验中是否有反应孔存在异常情况。黄色三角形中的数字1代表有一种异常情况，2代表有两种异常情况，以次类推。详细信息及解决方案可以在FlagDetails查看。,10、分析之后的结果，可以利用菜单中的FileExport功能，导出Excel格式的结果。或者视图板布局选中所需孔位右击Copy，粘贴。,若想存储图片结果，可直接在图片上单击鼠标右键，选择Saveas，存成JPEG格式的图片。,数据分析:四个阶段对数图线形图,基线、阈值线、Ct值,自动设置基线：每个样品都设置独立的基线，如果背景信号过高，软件可能会将背景信号误认为扩增信号，这时，基线的范围会被设置的很小，因此自动设置基线失败，需要手动设置基线。点击选择基线设置不正确的反应孔，取消“AutoThreshold”和“AutoBaseline”选项基线一般为3-15个循环,手动设定阈值：点击选择基线设置不正确的基因，取消AutoThreshold点击,日常实验中的注意事项,实验室分区：样品处理区、定量PCR反应制备区、扩增区移液器使用带滤芯的枪头先加阴性对照，后加样品，