离心技术与细胞器分离ppt课件

以离心技术与细胞器分离1、实验目的1、叶绿体、核分离为例，掌握离心机操作技术和两种不同的离心方法：差速离心法、密度梯度离心法； 2 .光镜鉴定各种细胞器的提取情况，了解叶绿体、核的形态。 2、2实验原理、离心技术(centrifugaltechnique )是基于粒子等速圆周运动时受到向外力的原理而发展起来的分离技术。 离心力(centriugalforce，Fc )是相对离心力(relativecentrifugalforce，RCF )、3、离心力(centriugalforce，Fc )、离心力是粒子以一定角度速度进行圆周运动时受到的向外的力。 离心力(Fc )的大小取决于角速度和旋转半径。 即，Fc=m2r这里是旋转角速度，弧度/秒单位r是离粒子的旋转中心的距离，cm单位m是质量，g单位。 4、相对离心力(relativecentrifugalforce，RCF )也称为相对离心加速度，离心力相当于重力加速度的倍数。 文献中常用“相对离心力”和“数字g”的表现。 RCF=(m2r)/(mg)=1.11910-5n2r式中r是离心转子的半径距离，以cm单位表示从离心管的重心到旋转轴中心的距离. g是地球的重力加速度(980cm/sec2) n是转子每分钟的转速(rpm ) . 5、6、概况、台高、超速离心机0.6-10万转/分钟以上、离心机基本分类、7、离心机结构、离心机主要部件为旋转轴、主轴、电机和驱动器、制动器、壳体和床。8、离心机旋转轴主要为角度旋转轴(angle-headedrotors )、摆平式水平旋转轴(swing-outrotors)/吊桶式旋转轴(swingbucketetrotors )、9、离心技术类型、常用离心技术为差速离心法(differentiation ) 10、差速离心法(differediffereallovecticyentrifugation )采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替离心，在不同离心速度和不同离心时间分离沉降系数不同的粒子的方法，称为差速离心法。 常用于从组织匀浆中分离各种细胞器。11、figure8-9molecularbiogyoftheell (garland science 2008 )、thepreparationveultracentriuge、12、差动离心法(diffferentitialvelocysttm ) 密度梯度离心原理：当不同粒子存在浮力密度的差异时，在离心力场中，粒子在密度梯度介质中沉降或浮起，移动到与各密度正好相等的位置，在此粒子无重量，离心力无论多长时间，他们都不再动，形成一系列密度区域。 分离不同浮力密度的物质。 等密度梯度离心一般以CsCl、RuCl、蔗糖、甘油等为介质。 该方法一般适用于物质大小相近、密度差异大的情况。 常用于分离提取核酸、亚细胞器和质粒。14、densitygradientcentrifugation、15、densitygradientcentrifugation、16、17、实验步骤、1 .用蒸馏水清洗材料。 用滤纸吸水后，去掉叶脉，取2克叶子，用剪刀剪下放入乳钵中。 2 .取10ml匀浆buffer，放入乳钵5ml后开始研磨。 用3.4层纱布过滤，将过滤液收集到10ml的离心管中，将剩馀的5ml均质buffer洗涤到乳钵中后也过滤到管中，以5000rpm离心5分钟，进行上清。 加入0.5%TritonX-1002.5ml，混合、振荡后静置3分钟，离心5分钟，进行上清。 5 .加入1 ml csk buffer振动混合，可在枪口轻轻沉淀溶解，18，6 .过滤(300目)，去除未分解的原生质体和分解的细胞膜内溶解物等大杂质，收集过滤液。 以上步骤提到的核不纯，其中混有原生质体、线粒体和叶绿体，以下以蔗糖密度梯度离心分离细胞核和叶绿体。在离心管的底部加入含有2.3M蔗糖的CSKbuffer3ml .此外，将3ml的60%percollcskbuffer轻轻放置在7溶液上，使用移液管时，必须将溶液沿着管道壁放置在其他溶液上观察层次现象。 10.3200g离心32分钟，溶液梯度层再分布。 11 .取各层溶液改良品红色苯酚染色、镜检。 观察不同大小密度细胞器的分布情况及其形态特征。19、试剂、匀浆buffer:5mMMES、6.8mmcacl2、11mmkh2po4、0.3M山梨糖醇、0.3M甘露醇、0.4 % PVP-30.csk buffer :100 mm KCl、3mmmgcl2、1mmegta(ph8.0 ) 300毫米sucrose.60 % perccollcskbuffer:60 % percollcoll，100毫米KCl，3毫米gcl 2，1毫米GTA (ph 8.0 )，10毫米pipes (ph 6.8 )，30