大肠杆菌表达系统PPT课件

大肠杆菌是外源基因受体细菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势通过全基因组测序，4405个开放式阅读框架基因克隆表达系统成熟，繁殖快，培养简单，操作方便，遗传稳定性被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。 表达外源基因受体细菌的大肠杆菌的特征外源基因表达的缺点真核蛋白的复性功能不足真核蛋白的修饰处理系统内源性蛋白酶解空间结构不正确的异种蛋白细胞的原主质包含广泛的内毒素，在大肠杆菌中高效表达外源基因的原理启动子终止亲本蛋白结合部位的质粒拷贝数，转录，翻译转录调控机制具有多纯半形结构的基因排列顺序是：启动子-操作基因-结构基因(lacZ-lacY-lacA)正调控因子CAP负调控因子lacI、启动子、lac表达系统，基因工程中使用的lac启动子都是抗糖代谢抑制突变，即PlacUV5，Lac表达系统lacUV5突变PlacUV5突变株，没有CAP的情况下可以非常有效地开始转录，由此控制的基因仅由转录级别的lacI控制，因此利用它创建的表达载体在使用上比野生型Plac更容易操纵。没有Lac表达系统负调节因子lacI诱导物质，lacI基因产物形成四聚抑制蛋白，与启动子下游的操作基因紧密结合，阻止转录的开始。laciplacolaczlxaaca、laciplacolaczlyaaca、tac表达系统tac启动子由Trp的35序列和lacUV5的10序列连接组成调节模式类似于lacUV5，但mRNA转录水平高于Trp和lacUV5启动子(Ptac=3Ptrp=11Plac)，因此，如果基因表达水平更高，则使用tac启动子优于使用lacUV5启动子。lac，tac启动子的宿主细菌要求在一般大肠杆菌中，LacI抑制蛋白只能满足细胞染色体上lac操作者转录调控的需要。lacO具有lacUV5、tac启动子的表达质粒转化为大肠杆菌，LacI抑制蛋白对lacO的比例明显降低，并不能保证每个LacO能获得足够的LacI抑制蛋白参与转录调控。la cuv 5，tac启动子在没有衍生物的情况下表现出更高的背景战士。lac，tac启动子宿主细菌的要求Lac，Tac表达系统为了具有严格控制外源基因转录的能力，产生过多lacI抑制蛋白的LacI基因的突变lacIq应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型为LacIq，经常被选为lac，Tac表达系统的宿主细菌。但是，这些菌株也对低副本的表达向量进行了严格的限制，因此，用高副本制作表达向量时，可以观察到高水平的下战士。要将LacIq基因插入表达载体，确保产生更多的LacI抑制蛋白。lac，tac表达系统中存在的问题IPTG用于诱导lac，tac启动子的转录，但IPTG本身具有一定的毒性。在安全方面，不适合表达和制造用于医疗目的的重组蛋白质。一些国家规定，生产者在使用重组蛋白质的生产过程中，对IPTG解决方法lac和tac启动子的转录进行严格控制，对热调节乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录进行严格控制，lac、tac表达系统中存在的问题Lac和tac启动子的转录进行温度限制调节，抑制蛋白LacI的温敏突变体lacI(ts)、Lac IQ(Lac IQ)使用乳糖代替IPTG的诱导lac和tac启动子中的转录乳糖在B- galactosidase的作用下产生充当诱导剂的异乳糖，该过程涉及乳糖的运输和转化，其效率受多种因素的影响和制约，因此乳糖诱导的有效容量远高于IPTG。乳糖本身可以由大肠杆菌代谢，如果乳糖存在更多，身体的生理特性和生长特性可能会发生变化。作为诱导剂替代lPTG的乳糖的研究应结合发酵过程提出良好的前景。转录调节机制色氨酸启动子Ptrp被色氨酸-抑制蛋白复合物抑制，以基底状态转录。从培养系统中去除色氨酸或添加3-吲哚丙烯酸(IAA)，可以有效地消除抑制效果。在正常细菌培养系统中很难去除色氨酸，因此基因工程中IAA诱导的PTrp介导的目的基因表达、启动子、Trp表达系统是基于大肠杆菌Trp操作者调控机制设计、构建的表达系统、Trp表达系统、PL和PR表达系统以l噬菌体早期转录启动子PL、PR为核心构建的表达，启动子、PL和PR表达系统转录调控机器原因l噬菌体PE启动子控制的cI基因的产物是PL、PR启动子转录抑制剂。大肠杆菌宿主中cI基因产物的浓度取决于一系列宿主和噬菌体因子之间复杂的平衡关系。因为通过细胞因子控制CI基因产物的生成和消失是很困难的。因此，PL和PR表达系统使用对温度敏感的突变cI857(ts)的基因产物来调节PL，PR启动子的转录。如果在较低温度(30)下以活性形式存在的在较高温度(42)下被停用时脱落，则PL和PR表达系统宿主细菌没有cI基因产品，PL、PR启动子的强度高的直接转录，具有PL或PR启动子的表达载体在一般大肠杆菌中相当不稳定。对宿主菌的要求是，以溶解l噬菌体的大肠杆菌为PL、PR启动子表达载体的宿主细菌N4830-1、POP2136等菌株溶解源cI857(ts)l噬菌体，使其在表达外源基因时可用作宿主细菌。将CI857(ts)基因组装到表达载体的宿主细菌的选择幅度更大。PL和PR表达系统中存在的问题是，PL和PR表达系统诱导时不添加化学诱导物，成本低廉，所以最初在大肠杆菌中制造的一些药用重组蛋白将利用PL或PR表达系统。缺陷在热脉冲诱导过程中也激活了大肠杆菌热休克蛋白的表达，其中有些可能分解蛋白质水解酶表达的重组蛋白。这种缓慢的加热方式对重组蛋白表达有一定的影响，在制造大规模发酵培养物时，将培养温度从30 提高到42 的热平衡交换方式影响诱导效果。T7表达系统Escherichia coli T7噬菌体有一套特异性很强的转录系统，利用该系统的组件构建的表达系统称为T7表达系统。T7表达系统T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性激活T7噬菌体启动子的转录。T7RNA聚合酶活性好，以比大肠杆菌RNA聚合酶快约5倍的速度合成RNA。能够转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在T7RNA聚合酶和T7吞噬启动子存在于细胞的情况下，大肠杆菌宿主自身基因的转录竞争仅由T7噬菌体转录系统，最终由T7噬菌体启动子控制的基因转录达到很高的水平。T7表达系统转录调节机制T7噬菌体启动子转录完全依赖T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的转录调节模式决定了表达系统的调节方式。化学诱导温度诱导双质粒系统、T7表达系统转录调控机制化学诱导噬菌体DE3是l噬菌体的诱导体，包含LacI、lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入int基因，并被调节为以噬菌体DE3作为表达载体的宿主细菌，是与lac表达系统类似的化学诱导型。T7RNA聚合酶基因，lac启动子，e. coli (DE3)，IPTG诱导，T7表达系统转录调控机制温度诱导PL启动子控制T7RNA聚合酶基因，通过热诱导刺激T7噬菌体启动子的转录。这种方法可以将背景转录降低到很低的水平，尤其适用于大肠杆菌宿主表达有毒的重组蛋白。T7RNA聚合酶基因，PL启动子，E.Coli(CE6)，热诱导，cI857，T7表达系统转录调节机制双质粒系统一个质粒具有T7RNA聚合酶基因，另一个质粒具有T7启动子和目的基因两个质粒的复制体解决方法之一是在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因。T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁的肽键外，还与T7RNA聚合酶结合，抑制其转录活性。目前，T7溶菌酶基因均通过共变性的ela引入表达系统，显着减少了背景转录，但对诱导后目的基因的表达水平没有太大影响。营养调控型利用大肠杆菌碱性磷酸酶基因phoA启动子或甘油3-磷酸转移系统ugp启动子构建表达载体。这两个启动子由培养基中无机磷(pi)的浓度控制(Pi)？其他表达系统，用糖原调控型构建了大肠杆菌半乳糖转移系统(mglBAEC)mgl启动子或沙门氏菌阿拉比他汀基因araB启动子的表达载体。这两个启动子被葡萄糖抑制，福柯和阿拉伯酸是他们的衍生物。其调节机制类似于利用Lac表达系统、其他表达系统、大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因cadA启动子的pH调节型。CadA启动子由培养基的h浓度，即pH值控制。(ph为8点抑制，ph为6点激活，ph为6点转录能量最高)。这个表达系统必须将细菌的发酵温度调节到27 30 ，才能稳定地表达目的基因。其他表达系统、溶解氧调节型构建大肠杆菌pyruvate lyase基因pfl启动子、硝基还原酶基因nirB启动子或透明除颤器血红蛋白基因vgb启动子。这些启动子都包含了对氧反应的调节因子fner的作用部位。在富氧条件下战士被抑制，没有氧气或在微氧条件下战士被激活。其他表达系统，溶解氧控制大肠杆菌GJ100透明颤血红蛋白基因(vgb)启动子控制T7RNA聚合酶基因表达质粒，vgb基因的转录由环境溶解氧浓度控制，vgb基因的启动子被激活。因此，将大肠杆菌GJ100用作宿主时，表达系统调节方式是氧气稀薄的诱导型，细菌发酵时的溶解氧浓度可以调节搅拌速度和通气量，与其他调节模式相比，更适合工业化生产过程。利用其他表达系统、生物素调节型大肠杆菌生物素操作者及其调节部位的表达载体的制作，在体内生长过程中生物素继续消耗，浓度达到2ng/ml以下时，启动子将被激活。没有外部世界，没有物理、化学信号的介入条件，自动诱导表达对象基因的特点是，很难精确地控制自动诱导的瞬间。，其他表达系统，加强转录终止所需的外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生逆转现象。也就是说，当RNA聚合酶滑动与终止子结构相邻的DNA序列时，长度不同的mRNA混合物形成过长的转录体，由于以下原因，会对外源基因表达产生很大影响：转录产物越长，RNA聚合酶转录1分子mRNA所需的时间就越长，外源基因本身的转录效率就越低。如果选择性标记基因和复制子结构等载体的其他重要基因或DNA功能区域与外部基因的下游接触，那么这里RNA聚合酶的转录可能会干扰质粒的克隆和其他生物学功能，导致重组质粒的不稳定性。过长的mRNA经常制造很多无用的蛋白质，增加工程细菌不必要的能量消耗；更严重的是，过长的转录物无法形成理想的二次结构，因此外来基因编码产物的翻译效率、终止符、强终止符的选择和目前常用于外来基因表达质粒的终止符来自大肠杆菌rRNA操作符的rrnT1T2和T7噬菌体DNA的Tf。对于一些终端效果弱的终端，使用二聚终止子系列的特殊结构，转录终止、终止子、核糖体结合部位外来基因在大肠杆菌细胞中高效表达，不仅与转录开始频率有关，而且与mRNA的翻译开始效率也有很大关系。大肠杆菌细胞内的mRNA分子的翻译效率不同，有时差几百倍。MRNA翻译的起始效率主要由核糖体结合位点(RBS)、核糖体结合部位Escherichia coli核糖体结合部位这5 端结构顺序决定。换句话说，翻译起始位于密码子上游的6至8个核苷酸序列5 UAAGGAGG3 由Shine-Dalgarno(SD)的序列组成，从大肠杆菌核糖体小个子键到16SrRNA3 结束区域3开始密码子翻译，大肠杆菌大部分基因使用AUG作为阅读框架的开始部分，部分基因开始翻译GUG或uuid，密码子SD序列和开始翻译密码子之间的距离，以及基本构成基因编码区域5末端的多个密码子碱基序列，核糖子结合部位，核糖子结合部位对外源基因表达的影响，SD序列一般是MD序列如果把这四个碱基中的任何一个换成c或t，大部分翻译效率都会大幅下降。核糖体结合部位、核糖体结合部位对外源基因表达的影响SD序列和起始密码子之间序列的影响如果SD序列的下游碱基是AAAA或UUU，则翻译效率最高。CCCC或ggggggg的翻译效率分别为最高值的50%和25%。与AUG相邻的前三