高效液相色谱法HPLC

1，高效液相色谱，highperformancelidchromatographyHPLC，2，教学概述，HPLC设备HPLC基本操作HPLC使用注意事项HPLC分类分析的实际问题，3，Agilent1100，仪器，仪器1 uv检测器2荧光检测器3蒸发光散射4差折射光检测器5电化学检测器6电导检测器7质谱，色谱仪是色谱分离作为高效液相色谱“心脏”的基础。、5、仪器配置、高压注入系统注入系统色谱分离系统数据处理系统、6、仪器配置、7、高压注入系统、溶剂脱气装置高压注入泵梯度洗脱装置、8、溶剂罐、用途，9、适用于溶剂脱气装置、真空脱气在线真空脱气注入泵前流动相连续真空脱气、多元溶剂系统。简单的高效液相色谱没有在线脱气装置，流动相必须使用离线脱气方法。10，真空脱气，11，溶剂脱气方法，离线脱气真空脱气超声波振动脱气氦脱气在线脱气方法，12，真空脱气，一般用小型真空泵降至0.050.07MPa，可以去除溶解气体。使用真空泵连接泵瓶，可以一起进行过滤和脱气双重工作。滤膜一般分为0.45m，有机相和水相膜，切割不可水相膜，过滤有机相。13，将流化床放入超声波清洗机，用超声波振荡10-30分钟即可。从液体到比空气溶解度低的氦，通过流速为60mL/min的10-15min，消除溶解在流动相气体中的现象。超声波振动脱气、氦气脱气、14、高压注入泵是HPLC系统中最重要的部分之一。注入泵的性能直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。15，注入泵性能，稳定流，RSD 0.5%。对定性量化的准确性很重要。流量范围大，分析类型必须在0.1-10ml/min范围内连续调整，准备类型可以达到100ml/min。输出压力高，一般高达400500kg/cm2。液体圆柱体积小，适用于梯度洗脱。密封性好，耐腐蚀性好。16，注入泵类型，1螺旋注射泵2往复活塞泵3往复隔膜泵4气动放大泵，目前使用柱塞往复泵最多。17，泵的使用和维护，防止任何固体颗粒流入泵体，因此必须经过流动阶段。流动相不应有腐蚀性物质，包含缓冲液的流动相不应整夜停止泵或在泵内保存更长时间。用纯净水充分清洗泵后，应更换为适于立柱保存和泵维护的溶剂。18、泵的使用和维护，防止空泵工作在流动阶段耗尽，柱塞磨损，气缸或密封损失环，最终泄漏。注入泵的工作压力不能超过规定的最大压力。否则，高压密封环可能会变形，导致泄漏(40MPa、400bar、5800psi)。适当地切断气体，以防止泵内产生气泡，影响流的稳定性，如果气泡太多，泵就不能工作。19，拔模洗脱装置，用途：拔模洗脱。等(isocratic)高性能液体洗脱拔模低压拔模洗脱方法高压拔模(内部拔模)、20、低压拔模、两个或多个溶剂在大气压力下以一定比例混合到泵前的比例输入比例阀后，使用高压泵将流量输出到恒定流。一般是四泵，例如水2690/2695。Agilent1100。特点：只要有一个高压注入泵，计算机就控制四比例阀，改变溶剂比例，实现二四次梯度洗脱，成本低，使用方便。溶剂在大气压力下混合，容易产生气泡，需要优秀的在线脱气装置。，21，拔模洗脱系统(低压拔模)，22，高压拔模，通常仅用于二元拔模，两个高压泵分别以设定比例向混合器输送两个不同的溶液，在高压状态下混合两个溶液，以恒定流输出。主要优点：通过渐变程序控制器，只需控制各泵的输出，即可获得所有形式的渐变曲线，精度高，自动控制简单。水515，23，拔模洗脱系统(高压拔模)，24，浇注系统，操作：将样品引入柱位置：高压泵与柱之间的类型：手动或自动注入机：6通阀，25，注入机，手动6通阀通过注射器自动，29、手动注入器、样品溶液用微注射器注入六通阀，注意事项HPLC专用平头微注射器，不能使用气相色谱提示微注射器。否则，六通阀可能会损坏。注入法：部分和完全装载法，30，注入法，部分装载法：注入的样本体积不得超过定量环体积的50%，每个注入体积必须准确和相等。完全加载方法：注入的样品体积应是最小定量环体积的3倍，完全替换定量环内流动相，消除管壁效应，确保注入准确性和再现性。31，32，自动注入机，通过计算机自动控制注入6通阀，计量泵和注入销，按照预准备的注入工作程序工作，自动执行定量取样、清洗销、注入、复位等过程。33，色谱分离系统，保护柱温度罐柱转换阀，34，柱，柱分离关键时，流动相方向应与柱的填充方向一致。列的列管外壁用箭头表示列的使用方向，以便在安装和更换列时，流向箭头指向的方向。35，柱(大小)，分析类型：4.6mm准备类型： 5mm以上微直径栏：2.1mm栏长：10-25cm，30cm稀有栏：直纹优质不锈钢栏，36，柱(填充(DP 33605um3umupl c1.7 um)列大小流相线路速度匹配，分离行为。38、柱的使用和维护，压力、温度和移动相组成的急剧变化，以及机械振动，总是用强溶剂清洗柱，用正己烷(或庚烷)、二氯甲烷、甲醇依次清洗柱中保存的硅柱等杂质，然后按相反顺序冲洗(所有溶剂必须严格脱水)，甲醇保持的极性反顺序清洗一氯甲烷(或三氯甲烷)，然后反顺序冲洗(如果下一次分析所用的流动上没有缓冲液，则省略最后用水冲洗)，一氯甲烷冲洗剩余的非极性杂质，清洗甲醇(乙腈)时，可以反复注入100 200 l四氢呋喃多次，乙腈、丙酮、丙酮。 一些柱温度计还有柱开关装置。列的工作温度会影响保留时间、相对保留时间、溶剂的溶解能力、列的性能以及流动上的粘度。一般来说，提高热温度可以提高组件在流动中的溶解度，降低分布系数k，从而缩短分析时间。也可以降低流动相粘度，降低主压力，提高主效率。41，检测系统，通用检测器差动折射光检测器(RID)蒸发光散射检测器(ELSD)专用检测器uv检测器(FD)电化学检测器(ECD)，42，uv检测器，可变波长uv检测器(VWD)，流动相包括缓冲盐的情况下，应使用乙酸铵等挥发性盐，浓度尽可能低，48，蒸发光散射探测器具有消除溶剂和温度变化引起的基准漂移的优点。在梯度洗脱的适用范围内，特别是检测低于适宜移动床的挥发性成分，不适合检测挥发性和半挥发性化合物，对磷脂、皂苷、碳水化合物和聚合物等其他探测器难以检测的化合物，49、HPLC分析的基本工作，1 .准备：移动床准备、脱气、样品准备。2.开机：依次打开计算机、泵、检测仪、热温度箱电源开关、仪器自检。3.柱：在已过滤和脱气的甲醇中插入吸入头，打开泵，使液体流出，将流量调节到0.2mL/min，连接柱(注意方向)，连接到探测器，直到液体从柱中流出。50，HPLC分析基本任务，4 .平衡：提高流速(一般分析列中的1mL/min)，约15min后更改准备好的流动相(流动盐或甲醇的比例低，中间需要适当转换)，以稳定基线。5.仪器面板或色谱工作站设置分析条件，如泵参数设置，如运行速度、流量比、高压极限和低压极限。设置检测器参数，如检测波长(nm)、灵敏度(AUFS)等。编辑样品名称、收集时间、样品体积等。51，HPLC分析基本任务，6。基准阶段稳定后，注入分析，收集图。7.设定用于指定峰值宽度、积分阈值、处理间隔、最小峰值面积和峰值高度的数据处理方法。记录和记录色谱信息(色谱峰区)。8.清洗全部决定后，请冲洗柱和线(溶剂洗脱强度调节从佃到大型洗涤柱)。52，HPLC分析基本操作，9 .使用面板功能或色谱管理软件调整流量，流量每次减少0.2mL/min，柱压力稳定后减少到0.2mL/min。10.关闭工作站，关闭工作站，然后关闭计算机。关闭每个部件的电源。11.注册使用记录。53，仪器使用注意事项，1 .HPLC分析用水全部精制，分解成新鲜的二次蒸馏水或蒸馏水。流动阶段应在过滤器、脱气后使用。样品需要过滤或高速离心分析样品。3.实验结束后，反相柱要用甲醇洗20 30分钟。如果流动中含有盐类或缓冲溶液，首先制造相同比例的无盐流动相清洗，逐渐变成95%的水溶液，然后逐渐用甲醇清洗，保护热和高压注入泵。54，HPLC分类，液-固色谱-液相色谱组合色谱离子交换体积排斥色谱，55，56，HPLC分类，液-液色谱3354。固定床是机械吸附在载体上的溶剂，是固定和不相互溶解的另一种溶剂。样品分子根据固定相和流动相之间分配的差异分离。57，HPLC分类，联合相色谱吸附分配色谱，液-液色谱改进的色谱方法。固定相使用化学共价结合在载体粒子上的有机固定相，而不是在液-液色谱中保持为机械涂层的液体。样品分子根据固定相和流动相之间的分布和吸附的差异而分离。，58、组合色谱分类、正相色谱反相色谱、59、A正相色谱、(1)基本概念(2)正相色谱分离原理(3)正相色谱固定相(4)正相色谱(5)正气相色谱固定相极性大于流动相的色谱方法。固定相极性比流动相大，因此这种相对关系与液固色谱完全相同，因此这种色谱方法称为正气相色谱。共价结合的固定相是一般的初级氨基及氰化物。61，(2)正色谱分离原理、正气相色谱分离原理不同于液固色谱，主要根据固定相和流动相分配系数的分离化合物分离。正色谱的可选特性在某些方面与液-固色谱相似，但与液-固色谱不同，它不适合分离几何异构体。62，(3)正色谱固定相，正色谱固定相最常见的是主氨基和氰、二醇、二甲基氨基和二氨基，它们以共价结合载体。正相色谱通常是固定相结构氰-(CH2)3c N-戊烷、n-乙烷、n-庚烷、环己烷等。移动上的极性越强，洗脱能力就越强。也就是说是强力溶剂。相反，是弱溶解剂。64，(5)双极性化合物分离的适宜两相色谱应用。酚、胺、多环化合物、染料、炸药、氢氧化物、氨基酸、药物等。这个样品在正乙烷或其他烷烃溶剂中的溶解度很小，在极性溶剂中的溶解度很好。用正色谱分离得到更好的结果。使用两相色谱时，一个值得注意的问题是，使用氨基作为固定相分离糖时，一些还原糖容易与固定相的氨基发生化学反应，产生席夫碱(shif fs base)。65，3)反相色谱，(1)基本概念(2)反相色谱分离原理(3)反相色谱固定相(4)反相色谱移动相(5)流动相和固定相之间的关系(6)实验条件对分离的影响(7)固定相极性小于流动相的色谱方法。固定相极性小于流动相，因此相对关系与液-固色谱相反，因此这种色谱方法称为反相色谱。共价结合的固定相是一些直线系碳氢化合物，如正玉器。67，(2)反相色谱分离原理、反相色谱分离原理主要根据分离的化合物疏水性在固定相上保留的时间进行分离。当水中有非极性溶质时，溶质分子之间的相互作用和溶质分子与水分子之间的相互作用比水分子之间的相互作用小得多，溶质分子在水中“挤”，从而增加了整个系统的熵，减少了自由能，使疏水化合物从流动中移动，停留在色谱仪上的时间变长。68，(3)反相色谱固定相，反相色谱固定相中最常见的是共价结合的线性饱和烷烃，其链长度也不同，最长的长度为18烷基，最常用的固定相。反相色谱中常用的颗粒结合相官能团载体颗粒直径十八烷基Zorbax310mm辛基Nuc