郭勇酶工程(第三版)第六章固定化酶.ppt

Chapter6ImmobilizedEnzyme,第六章固定化酶和固定化细胞、原生质体,制作：郑穗平,酶催化的优点作为一种生物催化剂，酶参与生物体内的各种代谢反应，具有专一性强、催化效率高及作用条件温和等优点。,酶应用过程中的一些不足,酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。,固定化技术,在早期的科学研究和生产实践中，酶一直都是以溶于水的游离状态进行催化反应的，但游离酶即使在酶反应的最适条件下进行催化，也还存在着容易失活、反应后不能回收等缺陷，有时不易与产物分开，影响产品提纯及质量。,设想如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊的相，使它与整体相（或整体流体）分隔开，但仍能进行底物和效应物（激活剂或抑制剂）的分子交换。这种固定化的酶可以象一般化学反应的固体催化剂一样，既具有酶的催化特性，又具有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，并且生产工艺可以连续化、自动化。,进展经过40多年的研究和发展，酶的固定化技术取得了长足的进步。它不仅在理论研究（如阐明酶作用机理）上发挥独特作用，在实际应用上也显示出强大威力。用这种技术不仅能稳定酶，改变酶的专一性、提高酶活力，从而改善酶的种种特性，使之更符合人类要求，而且还能创造适应特殊要求的新酶。,现状人们对固定化酶极感兴趣，因为其性质比可溶性酶及其相关技术优越，对固定化酶的利用也与日俱增。,1、什么是固定化技术和固定化酶,2、固定化酶的研究历史,3、酶的固定化技术,4、固定化酶的特点,Go,Go,Go,Go,6、细胞、原生质体的固定化,5、固定化酶的应用,Go,5.1什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶（固定化酶）,固定化技术,1.固定化酶(immobilizedenzyme)固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。,固定化酶：经提取和分离纯化后的酶,固定化菌体(死细胞)：含酶菌体或菌体碎片,固定化细胞：在一定的空间范围内进行生命活动的细胞,2、固定化方法,固定化方法,酶的固定化方法,吸附法,结合法,交联法,包埋法,网格型,微囊型,热处理法,固定化酶与游离酶相比，具有下列优点（l）极易将固定化酶与底物、产物分开；（2）可以在较长时间内进行反复分批反应和连续反应；（3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；（4）酶反应过程能够加以严格控制；（5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；（6）较游离酶更适合于多酶反应；（7）可以增加产物的收率，提高产物的质量；（8）酶的使用效率提高，成本降低。,缺点：(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。(2)酶活性下降。,固定化酶是二十世纪五十年代开始发展起来的一项技术、最初是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”（waterinsolubleenzyme）和“固相酶”（solidphaseenzyme）。,5.2固定化酶的研究历史,但是后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出，在这种情况下，酶本身仍处于溶解状态，只不过被固定在一个有限的空间内不会流失。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不恰当了。,固定化酶正式定名在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”（immobilizedenzyme）的名称。,1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilizedenzyme。,随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固定化细胞技术。1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。,1986年至今，利用固定化原生质体技术进行胞外酶的生产研究。用固定化枯草杆菌原生质体生产细胞间质中存在的碱性磷酸酶等，前景广阔。,5.3酶固定化技术,活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。,固定化酶操作的注意事项,固定化酶的制备原则固定化酶的应用目的、应用环境各不相同，而且可用于固定化制备的物理、化学手段、材料等多种多样。,制备固定化酶要根据不同情况（不同酶、不同应用目的和应用环境）来选择不同的方法，但是无论如何选择，确定什么样的方法，都要遵循几个基本原则,原则1必须注意维持酶的催化活性及专一性，保持酶原有的专一性、高效催化能力和在常温常压下能起催化反应的特点。,原则2固定化应该有利于生产自动化、连续化。为此，用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。,原则3固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量，制备固定化酶时所选载体应尽可能地不阻碍酶和底物的接近。,原则4酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用，因此，在制备固定化酶时，应使酶和载体尽可能地结合牢固。,原则5固定化酶应有最大的稳定性，在制备固定化酶时，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。,原则6固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性，在制备固定化酶时，酶和载体结合部位不应是酶的活性中心或与维持酶高级空间结构有关的基团，因此，应尽可能预先保护这些基团；,原则7固定化酶应易与产物分离，即能通过简单的过滤或离心就可回收和重复使用；,原则8固定化酶成本要低，应为廉价的、有利于推广的产品，以便于工业使用。,1、吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。,2、包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。,根据载体材料和方法的不同，可分为：凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。半透膜包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等,首先被采用包埋法的是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙烯酰胺，丙烯酰胺，引发剂,（1）琼脂凝胶包埋法将一定量的琼脂加入到一定体积的水中，加热使之溶解，然后冷却至4855C，加入一定量的酶液，迅速搅拌均匀后，趁热分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球状固定化细胞胶粒，分离后洗净备用。缺点：机械强度较差，底物、产物扩散困难，故使用受限制,（2）海藻酸钙凝胶包埋法称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的酶液或细胞混合均匀，然后用注射器或滴管将冷凝悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中。优点：操作简便、条件温和，对细胞无毒害，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径。使用时注意控制培养基中磷酸盐的浓度，维持一定的钙离子浓度。,海藻酸钙包埋法装置,将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸钠中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。,颗粒大小可实时监控,（3）角叉菜胶包埋法角叉菜，属褐藻门，杉藻科，角叉菜属，自然分布于大西洋沿岸和我国东南沿海以及青岛、大连等海域，是中国的一种重要经济海藻。角叉菜不仅是卡拉胶生产的重要原藻，而且近年来越来越多地应用于医药领域，引起人们的广泛关注。,将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水中，加热溶解。灭菌后冷却到30-50C，与一定量的酶液等混合均匀后，趁热滴到预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植物油中，成型后再置于氯化钾溶液中的到球状固定化颗粒。优点：通透性能好，对细胞无毒害。,（4）明胶包埋法将一定量的明胶悬浮于一定体积的水中，加热溶解。灭菌后冷却到35C以上，与一定量的酶液等混合均匀后制成所需形状的胶粒。机械强度不够可用戊二醛等双功能试剂交联。,（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法先配置一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺（N,N-甲叉双丙烯酰胺，别名MBA，又叫亚甲基双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰胺，N,N-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温或强光则自交联，微溶于水、乙醇）与一定量的酶液等混合均匀后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二胺，混合后让其静置聚合即可获得。优点：机械强度高，可调节凝胶孔径缺点：丙烯酰胺单体有毒性,（6）光交联树脂包埋法例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得优点：强度高、使用时间长固定化时间短缺点：,凝胶包埋法,使用的多孔载体及其特点,（7）半透膜（微囊型）包埋法是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。半透膜的孔径只有几至几十，所以也称为微囊化法。适用于底物和产物都是小分子物质的固定化,脂质体包裹,3、结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。,根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，,（1）离子键结合法载体阴离子交换剂如DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶，AmberliteIRA-93，410，900；阳离子交换剂如，CM-纤维素，AmberliteCG-50，IRC-50，IR-120，Dowex-50等。,离子结合法的优点操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。,缺点载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。,迄今已有许多酶用离子结合法固定化，例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。,（2）、共价键结合法概念：非水溶性载体与酶以共价键的形式结合可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体,可与载体共价结合的酶的功能团或氨基、或-羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等。参与共价结合的氨基酸残基不应是酶催化活性所必需的，否则往往造成固定后的酶活性完全丧失。,共价键结合法制备固定化酶的“通式”首先载体上引进活泼基团然后活化该活泼基团关键最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键,载体活化的方法A重氮法B叠氮法C烷基化反应法D硅烷化法E溴化氰法,A重氮法,目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等该方法需要载体具有芳香族氨基,B叠氮法对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联,C烷基化反应法含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体,D硅烷化法多孔玻璃特点：机械强度好，表面积大。耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷,E溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。,共价结合法与离子结合法或物理吸附法相比的优点酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。,缺点反应条件苛刻，操作复杂；会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心。因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般为30左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。,4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。,戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。,常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。,1、交联法常用试剂常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(schiff)席夫碱（Schiffbase）由内酰胺类或其他聚合物与碱金属、碱土金属的氧化物或氢氧化物，或它们的混合物反应制得。,5、热处理法将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内而制备得到的固定化菌体。只适用于热稳定性较好的酶的固定化，严格控制加热温度和时间。热处理法也可以与交联法或其他固定化方法联合使用。,第一个离子结合法固定化酶：DEAE-Cellulose固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶：DEAE-SephadexA-50固定化氨基酰化酶,6.4固定化酶的特性：,将酶或含酶菌体固定化制成固定化酶或固定化菌体以后，由于受到载体等的影响，酶的特性可能会有些变化。,本章目录,1、固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。贮存稳定性和操作稳定性比游离酶大多数提高对热稳定性绝大多数提高对蛋白类分解酶的稳定性提高对变性剂的耐受力升高,2、固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。3、固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起。,作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化如氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶等既可作用于低分子底物又可作用于大分子底物的酶特异性往往会变化。如胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白质，又可作用于低分子的二肽或多肽；固定在羧甲基纤维素上以后，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3%左右。,4、酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质,pH对固定化酶的影响载体带负电荷，pH向碱性方向移动,载体带正电荷，pH向酸性方向移动,产物性质对体系pH的影响催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH值比游离酶的pH值高；反之则低,5、评价固定化酶的指标：（1）.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。（2）.操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）,(3).相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力,Aminoacylase氨基酰化酶,6.5固定化酶的应用,1、固定化酶在工业生产中的应用（1）氨基酰化酶,世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60左右。,储罐,反应产物,消旋反应器,固定化酶柱子,晶体L-Ala,L-AlaA-D-Ala,A-L-AlaA-D-Ala,（2）、高果糖浆的生产-葡萄糖异构酶,将培养好的含葡萄糖异构酶的放线菌细胞用6065热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。,葡萄糖异构酶世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。,（3）、天冬氨酸酶1973年日本用聚丙烯酰胺凝胶作为载体，将具有高活力天冬氨酸酶的大肠杆菌菌体包埋制成固定化酶，用于延胡索酸转化生产L-天冬氨酸。也可以将天冬氨酸酶从大肠杆菌中提取出来，用离子键结合法制成固定化酶用于生产。,NH3,+,（4）、青霉素酰化酶(penicillinamidaseE.C.3.5.1.11,简称PA)能催化水解青霉素产生6-氨基青霉烷酸(6-aminopenicillanicacid,简称6-APA),水解头孢菌素产生7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-aminodesacetoxycephalosporanicacid,简称7-ACA).该酶还能以6-APA或7-ACA为母核,催化合成各种不同的半合成青霉素(如氨基苄青霉素、羟氨苄青霉素等)或头孢菌素.由于半合成青霉素在效力与临床价值上优于青霉素,而青霉素又很容易通过发酵而大量生产,因此近几十年来,有关青霉素G水解生产6-APA的研究一直是一个热点.,青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素,7-APAasnucleus,青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素,7-ACCAor7-ADCAasnucleus,青霉素酰化酶转化流程图,（5）延胡索酸酶？1974年，用聚丙烯酰胺凝胶，包埋的含有延胡索酸酶的产氨短杆菌菌体，制成固定化延胡索酸酶，生产L-苹果酸。,+H2O,L苹果酸是生物体可以利用的形式，它常配以复合氨基酸注射液（手术后重要的营养药品）中，以提高氨基酸的利用率，这对手术后虚弱和肝功能障碍病人尤其重要。L苹果酸钾是良好的钾补充药，它能保持人体的水分平衡，治疗水肿、高血压和脂肪积聚等症。L苹果酸是治疗肝病，尤其是肝功能障碍导致的高血氨症的良好药物。L苹果酸钠具有食盐的1/3咸味，可作肾脏病人代食盐。,（6）-半乳糖苷酶又称为乳糖酶，用于水解乳中存在的乳糖，生成半乳糖和葡萄糖用于制造低乳糖奶已于1977年实现工业化乳糖+水葡萄糖+半乳糖,（7）脂肪酶脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。已经有多种固定化脂肪酶用于工业化生产,（8）植酸酶植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。植酸酶具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸（盐）降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸（盐）结合的其它营养物质。固定化植酸酶已经工业化生产，广泛用于饲料行业。,（1）作为治疗药物固定化酶由于其高稳定性，低免疫性，使其在作为治疗药物时，较之溶液酶，表现出极大的优势。作为治疗药物，溶液酶具有一些“致命”弱点：酶作为异体物质，反复应用会导致免疫反应,2、固定化酶在医学上的应用,酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白酶水解破坏。由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度。溶液酶的这些缺点，通过选择适宜的载体与方法将它们固定化以后就能逐一地加以解决。,消血栓：纤溶酶是异源蛋白质，可在人体内引起免疫反应，无法长期使用。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。,人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。,将血液引出体外利用透析、过滤、吸附、膜分离等原理排除体内过剩的含氮化合物，新陈代谢产物或逾量药物等，调节电解质平衡，然后再将净化的血液引回体内。利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效。,3、固定化酶在酶传感器方面的应用,酶传感器是由固定化酶与能量转换器两部分组成的传感装置，其中酶是与适当的载体结合形成的不溶于水的固定化酶膜。最常用的酶传感器是酶电极，即将固定化酶膜与转换电极做在一起，当酶膜与被测物发生催化反应而生成电极活性物质后，电极测定活性物质并将其转换为电信号输出。,固定化酶和电化学传感器的结合。优点：既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。,（1）酶电极,酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出酶电极并把它用于葡萄糖的定量分析。酶电极一般可根据电极检测物理量的不同分为电流型和电压型，前者一般有氧电极、H2O2电极等，后者有NH3、CO2、H2电极等。较典型的一种酶电极为葡萄糖酶电极。,酶电极,Glucose,Gluconicacid,Glucoseoxidase,Oxygen,Hydrogenperoxide,Membrane,Electrode,根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。,例：用聚丙烯酰胺凝胶包埋法将葡萄糖氧化酶固定化，制成厚度为2050m的酶膜，再与氧电极和使氧容易通过的聚四氟乙烯等高分子薄膜密切结合，组成葡萄糖氧化酶电极。使用时，把酶电极浸入样品溶液中，样品液中的葡萄糖扩散到酶膜中，酶催化葡萄糖与氧反应，生成葡萄糖酸，使氧被消耗，再由氧电极测定氧浓度的变化，即可知道样品中葡萄糖的浓度。,葡萄糖酶电极结构示意图,葡萄糖酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化酶（GOD），它被固定在聚乙烯酰胺凝胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧化反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧化氢。通过用电极测量被消耗的氧或生成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度。,手掌型葡萄糖(glucose)分析仪,青霉素酶电极以固定化青霉素酶的酶膜与pH电极结合而成。如：将青霉素酶固定在聚丙烯酰胺凝胶或光交联树脂膜内，然后紧贴在玻璃电极（pH）上即成。当酶电极浸入含有青霉素的溶液中时，青霉素酶催化青霉素水解生成青霉烷酸，引起溶液中氢离子浓度增加，即反映到pH电极上从而测定青霉素的含量,酶电极特点：快速、方便、灵敏、精确固定化方法一般采用凝胶包埋法，制成酶膜。,（2）水质监测用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物。,德国研发的环境废水BOD分析仪,（3）食品鲜度鱼鲜度传感器在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内ATP经酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用K值表示：K=肌苷+次黄嘌呤/ATP+ADP+AMP+IMP+肌苷+次黄嘌呤+尿酸,大多数鱼死后520h，ATP，ADP和AMP已分解尽，超过24h，鲜度主要取决于IMP-肌苷-次黄嘌呤-尿酸。将这三个步骤的三种酶（5核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。当K20时，鱼极新鲜，可供生食。K在2040之间为新鲜，必须熟食。K大于40，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。,肉鲜度传感器,肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新鲜程度。用腐胺氧化酶与过氧化氢电极构成多胺生物传感器，或用单胺氧化酶膜和氧电极组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。,一些常见的酶电极,本章目录,6.6固定化微生物细胞的特点与应用,1、固定化微生物细胞的定义和特点生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器）活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞）形状：多使用颗粒状珠体使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性，只要载体不解体，不污染就可以长期使用。,类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞方法：主要采用吸附法和包埋法通过各种方法，将细胞与水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程，称为细胞固定化固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。,（1）固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构，能够进行正常的生长繁殖（2）固定化微生物细胞保持了细胞内原有酶系、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行正常的新陈代谢和调节控制（3）固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好，可以反复使用或连续使用较长一段时间（4）固定化微生物细胞密度提高，可以提高产率（5）载体起保护作用，可以提高基因工程菌的质粒稳定性,1、吸附法(1)基本概念：利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法。(2)常用吸附剂：硅藻土，多孔陶瓷、多孔玻璃，多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。(3)吸附法固定化细胞的应用a.固定化微生物细胞：酵母细胞带有负电荷，在pH35的条件下能够吸附在多孔陶瓷或多孔塑料等载体的表面，制成固定化细胞，用于酒精和啤酒等的发酵生产；,b.固定化植物细胞：吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁。用于生产色素、香精，药物和酶等次级代谢物；,c.固定化动物细胞：动物细胞大多数属于附着细胞，必须依附在固体表面才能正常生长，故可吸附在容器壁，微载体和中空纤维外壁等载体上，制成固定化动物细胞，用于各种功能蛋白质的生产。吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地附着在容器壁、微载体和中空纤维等载体上。其中微载体已有专门生产出售，供固定化动物细胞之用。,2、包埋法：(1)基本概念：将细胞包埋于多孔载体内部而制成固定化细胞的方法，称为包埋法，包埋法能保持多酶系统，是目前制备固相细胞最常用的方法。包埋法又分为凝胶包埋法和半透膜（胶囊）包埋法。(2)凝胶包埋法：以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内，而使细胞固定化的方法，称为凝胶包埋法。凝胶包埋法常用载体有：琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。a.琼脂凝胶包埋法b.海藻酸钙胶包埋法c.角叉莱胶包埋法d.明胶包埋法e.聚丙烯酰胺凝胶包埋法f.光交联树脂包埋法(3)半透膜胶囊包埋法：将细胞分散于有机溶剂中成乳化液，此时，细胞被一层液态膜包围，形成具有半透膜胶囊的固相细胞。,3、固定化微生物细胞的应用（1）、利用固定化微生物细胞生产各种产物：固定化微生物细胞能进行正常的生长，繁殖和薪陈代谢，所以利用固定化细胞可以如同游离细胞那样发酵生产各种代谢物。由于微生物固定化后，受载体的影响，故固定化微生物只用于生产各种能够分泌到细胞外的产物。其中主要有下面几类物质：,(1)酒精酒类：固定化酵母等微生物可用于生产酒精、啤酒、蜂蜜酒、葡萄酒、米酒等。有的巳完成中试，实现了工业化生产。(2)氨基酸：固定化氨基酸生产菌可用于生产谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、瓜氨酸、色氨酸、异亮氨酸等氨基酸。(3)有机酸：固定化黑曲霉等微生物可生产苹果酸、柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、醋酸等有机酸。,(4)酶和辅酶：固定化微生物可用于生产。淀粉酶。糖化酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、溶菌酶、磷酸二酯酶、天门冬酰氨酶等胞外酶以及辅酶A，NAD，NADP、ATP”等辅酶(5)抗生素：固定化微生物在生产青霉素，四环素，头孢霉素。杆菌肽、氨苄青霉素，等抗生素方面的研究，成果显著。(6）固定化微生物细胞还可以用于甾体转化及有机溶剂、维生素、化工产品等的生产。,(2)、固定化微生物细胞制造微生物传感器：微生物传感器是由固定化微生物细胞与各种能量转换器(电极，燃料电池，场效应管等)密切结合而成的传感装置。微生物传感器分为呼吸活性测定型和电极活性测定性两种。,呼吸活性测定型：利用固定在高分子膜上的微生物细胞的呼吸作用，测定氧气的消耗和二氧化碳的生成，从而确定被测定物质的量。这种呼吸活性测定型传感器由固定化微生物膜和氧电极或二氧化碳电极结合而成。,电极活性测定型：利用固定上的微生物细胞的新陈代谢作用，测定电极活性物质的量的变化从而确定样品中欲测物质的含量，这种传感器由固定化微生物膜与生物燃料电池、离子选择电极和气体电极等组成。微生物传感器巳成功地用于测定可发酵性糖，葡萄糖、甲酸、乙酸，甲醇、乙醇、头孢霉素、谷氨酸、氨、硝酸盐，生化需氧量(BOD)、细胞数量等。,4、固定化植物细胞(1)、固定化植物细胞特点a植物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可减轻剪切力和其他外界因素对植物细胞的影响提高植物细胞的存活率和稳定性。b细胞经固定化后，被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团。,c固定化植物细胞发酵可以简便地在不同的培养阶段更换不同的培养液，即首先在生长培养基中生长增殖，在达到一定的细胞密度后，改换成发酵培养基，以利于生产各种所需的次级代谢物。d固定化植物细胞可反复使用或连续使用较长的一段时间，大大缩短生产周期，提高产率。e固定化植物细胞易于与培养液分离，利于产品的分离纯化，提高产品质量。,6.7原生质体固定化,1、概述（1）、基本概念：将微生物细胞和植物细胞去细胞壁后，可得原生质体，将此原生质体用多孔凝胶包埋，即为固定化原生质体。（2）、固定化细胞的缺陷a只能用于生产胞外酶和其它能够分泌到细胞外的产物。b由于载体的影响，营养物质和产物扩散受到一定限制。,（3）、固定化原生质体的优点：a促进胞内物质分泌到胞外。b有利于氧的传递，营养物质的吸收。,2、原生质体制备(1).制备原则：a既要破坏细胞，又不能影响到细胞膜的完整性。b不能使细胞内部结构受到破坏。(2).制备方法：主要使用对细胞壁有专一性作