真核基因在大肠杆菌中的表达ppt课件

真核基因在大肠杆菌中的表达,琚春梅华南农业大学兽医学院微生物教研室2006-11-30,1,基因与基因工程基因操作的主要技术原理基因克隆的酶学基础基因克隆的载体基因的分离与鉴定基因的表达与调节,已讲述的内容,2,讲述的内容提纲,真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体真核基因在大肠杆菌中的表达影响真核基因表达效率的因素,3,第一节真核基因的大肠杆菌表达体系,4,1.大肠杆菌表达体系,基因工程的重要目标制备大量纯化的蛋白质产物因此，要选择能高水平表达异源真核蛋白的表达系统目前常用的表达系统细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动物细胞等,5,背景清楚，特别是对其基因工程表达调控的分子机理研究的比较深入。安全，且有多种不同的菌株和质粒载体。已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进行批量生产,大肠杆菌表达系统的优越性,6,真核基因与原核基因的差别：编码基因的不连续性，含有内含子序列，大肠杆菌不具备对pre-RNA进行加工剪接的能力。转录信号的不同：真核基因转录的mRNA不具备结合细菌核糖体所必须的SD序列；细菌的RNA聚合酶不能识别真核启动子。真核基因mRNA5-端有帽子结构，3-端有poly(A)尾巴，影响其稳定性及与细菌核糖体结合的能力，从而阻碍正常的转录和翻译。,真核基因在大肠杆菌中表达存在许多障碍,7,解决方案,将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游。从真核细胞中分离完整加工的mRNA，采用反转录合成cDNA，并连接到合适的载体上，可以克服内含子问题。如果知道蛋白质的氨基酸序列，且分子量不太大，可以用化学方法合成不含内含子序列的寡聚核苷酸片断。对于细菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通过突变的方法消除。,8,许多真核基因的蛋白质产物存在翻译后的修饰过程：磷酸化、糖基化等，大肠杆菌中无此过程，因此，表达的蛋白无法正确折叠，由此产生的三级结构通常是不可溶的，常形成包涵体，无活性。表达的真核蛋白质被细菌的蛋白酶识别并降解。,真核基因在大肠杆菌中表达存在许多障碍,9,2.克隆基因正确表达的基本条件,最基本条件：能够进行正常的转录和翻译转录：真核基因置于原核启动子的下游3-末端具有转录终止子翻译：mRNA分子具有RBS（ribosomebindingsite）包括AUG或GUG和与16SrRNA3-末端互补的SD（Shine-Dalgarno）序列。,10,另一个重要条件：编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。表达蛋白被大肠杆菌蛋白酶降解。蛋白质三级结构形成的速率与其稳定性有关。蛋白质三级结构的正确形成需要分子伴侣的参与。大肠杆菌不可能对所有外源蛋白都存在正确的分子伴侣。,11,第二节大肠杆菌的表达载体,12,大肠杆菌表达载体的基本结构特征,13,1.表达载体的基本成分,启动子：影响外源基因的表达水平使外源基因高水平表达必须具备的条件：强启动子启动子呈现一种低限的基础转录水平：表达的外源蛋白可能对寄主细胞不利。诱导型启动子：能通过简单的方式使用廉价的诱导物使外源基因获得表达，如IPTG、温度等。,14,转录终止子上游启动子会抑制下游启动子的转录功能(启动子封堵作用)，因此需要在克隆基因编码区的3-末端接上一个有效的转录终止子。转录终止子能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。,15,翻译起始序列：决定mRNA的翻译起始效率。未鉴定出其保守结构，只能采取一些方法降低mRNA5-末端二级结构的形成，增加RBS中A、T含量，碱基定点突变等。增强子：特殊的序列元件，能显著增强外源基因的表达效率。,16,翻译终止子：必须存在终止密码子。构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子(UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖体的跳跃现象。大肠杆菌最偏爱的密码子：UAA当为四联核苷酸UAAU时，终止效率进一步增强。,17,2.常用的大肠杆菌表达载体,lac启动子的表达载体,乳糖操纵子结构模型,18,19,有乳糖存在时,20,lac操纵子受lac阻遏物的负调节。培养基中缺乏乳糖或其它诱导物时，lac阻遏物同操纵单元结合，关闭乳糖操纵子的活动。培养基中加入乳糖或其它诱导物(IPTG)时，同阻遏物结合，使乳糖操纵子去阻遏。因此，我们可以通过加入IPTG诱导来实现外源基因的表达。,21,lac操纵子的控制区，包括核糖体结合区、RNA聚合酶结合区及阻遏物结合区都位于长203bp的HaeIII片断上。203bp的HaeIII片断含有lac启动子、操纵单元及-半乳糖苷酶的前8个密码子。可以将该片断插入到质粒中，构建含有lac启动子的质粒表达载体。,22,这种多拷贝质粒中的操纵单元可以把大肠杆菌中所有的lac阻遏物都结合掉，使细菌染色体的-半乳糖苷酶基因解抑制。含有质粒载体（lac启动子、操纵单元）的大肠杆菌能够合成-半乳糖苷酶，因此菌落在加有X-gal(底物)的琼脂平板上呈蓝色。这种显色反应可用来快速鉴定阳性克隆。,23,trp启动子的表达载体,24,Trp高时,Trp低时,mRNA,O,P,trpR,调节区,结构基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,?,色氨酸操纵子,25,色氨酸不是作为诱导物，而是作为辅阻遏物结合trp阻遏分子。被色氨酸激活的trp阻遏分子同操纵单元结合后，就使得RNA聚合酶失去同trp启动子结合的机会，从而关闭trp基因的转录。因此，当色氨酸浓度低时，trp基因转录才能开始。,26,将trp操纵子插入到质粒载体中，可以构建含有trp启动子的表达载体。这种载体转化大肠杆菌后，经3-吲哚丙烯酸诱导，可使外源基因获得高效表达。该表达载体优点：表达蛋白产量高于lac操纵子表达系统。,27,PL启动子的表达载体,28,来源于噬菌体，是一种最广泛使用的大肠杆菌表达载体的启动子之一。受阻遏基因cI编码蛋白的正调控。cI基因存在一个温度敏感突变等位基因，即cI857。cI857或存在于大肠杆菌染色体上，或存在于相容性的质粒分子上。,29,cI阻遏蛋白在42时失活，因此大肠杆菌在42培养时，PL启动子启动转录；而在28-30培养时，cI阻遏蛋白有活性，使PL启动子处于抑制状态，转录停止。利用这一特性，我们只要简单地改变培养温度，就可以诱导或关闭PL启动子的活性。将PL启动子克隆到质粒载体上，可以构建由PL启动子启动的表达载体。,30,31,32,第三节真核基因在大肠杆菌中的表达,33,1.外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,细胞质中表达：易形成包涵体包涵体：由不可溶性蛋白聚集折叠形成，是外源基因高效表达时常发生的一种特殊生理现象。包涵体形成的理化参数：对E.coli80种蛋白研究获得。电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基的组分、半胱氨酸的组分、脯氨酸的组分、亲水性和氨基酸残基的总数。,34,分析蛋白质的氨基酸组分可以预测包涵体形成的概率。每种氨基酸出现在各种二级结构中的倾向或者频率不同。例如：Glu(谷aa)主要出现在螺旋中Asp(天冬aa)和Gly(甘aa)主要分布在转角中Pro也常出现在转角中，但一般不会出现在螺旋中,35,36,表达蛋白形成包涵体的优缺点：优点：易于分离蛋白被保护而免受胞内酶的降解蛋白质没有活性，不会对寄主细胞造成伤害缺点：很难恢复生物学活性蛋白质的终产量低,37,解决方案：限制包涵体的形成外源基因与分子伴侣共表达分子伴侣：能够阻止聚合作用而使蛋白质正确折叠。使用硫氧还蛋白缺陷的寄主菌株目的：维持有利的氧化还原电位低温诱导，降低蛋白质的合成速率与高可溶性的多肽融合表达,38,周质中表达优点：周质中细胞蛋白少，有利于外源蛋白的纯化。周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠。周质中蛋白质的降解作用小。条件：需要信号肽的引导，使表达蛋白由细胞内膜转运到周质。信号肽：有原核的信号肽，也有真核的信号肽。,39,蛋白转运过程相当复杂蛋白质跨膜过程还与细胞的结构特征有关。即使存在信号肽，也不能保证蛋白正确转运到周质中。如：免疫球蛋白与T-细胞受体分子结构相似。免疫球蛋白可以在周质中表达。T-细胞受体不能在周质中表达。,40,细胞外表达：易于分离纯化，但相当困难。原因：细菌细胞有两层膜，即内膜和外膜，表达蛋白需跨越两层膜屏障。解决方案：利用大肠杆菌固有的途径：将外源蛋白与E.coli分泌型蛋白融合表达。增加E.coli细胞外膜的渗漏性：信号肽序列、透化剂、与细菌素释放蛋白或具透化作用的基因共表达。,41,2.融合蛋白的表达,融合基因的概念：具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。DNA体外重组构建的融合基因：外源基因与启动子融合：编码产物不一定是融合蛋白。两个或以上不同基因的编码序列组成的融合基因：编码产物为单一的多肽序列，称为融合蛋白、杂种蛋白、嵌合蛋白。,42,融合蛋白质配偶体作用：阻止包涵体的形成改善蛋白质的折叠性能限制蛋白酶的酶解简化蛋白质的检测与纯化程序种类：GST、His6、MBP等,43,表达融合蛋白的策略用融合载体表达融合蛋白质：在设计时注意外源基因与靶基因连接后仍保持正确的读码框。,BamHI,SmaI,EcoRI,XbaI,NcoI,SalIXhoI,SacI,HindIII,44,用融合载体组合表达融合蛋白质：在克隆外源基因时，不用考虑读码框问题。,45,用pBR322质粒载体表达融合蛋白质pBR322质粒载体中含有唯一的PstI位点用末端脱氧核糖核苷酸转移酶和dGTP或dCTP进行同聚物加尾。G、C配对，T4DNA连接酶连接后，总有一部分具有正确的读码结构。,46,融合蛋白的纯化：利用与融合蛋白中的配偶体相对应的配体作为吸附剂，制备亲和层析柱。通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白被滞留下来，其它蛋白则流出柱外。通过洗脱处理，可回收到纯化的融合蛋白。,47,48,融合蛋白的切割：配偶体的存在可能影响融合蛋白的功能。方法：化学切割：如溴化氰特异切割甲硫氨酸残基，AUG不是起始密码子时编码，适合链内不含甲硫氨酸残基的多肽的切割。,49,酶切割：如凝血因子Xa，在融合基因之间插入编码Xa的识别序列，融合蛋白纯化后可用Xa切除大肠杆菌的多肽，得到天然的目标蛋白。,50,3.外源蛋白在大肠杆菌中的稳定性,影响因素：蛋白的酶解作用：细菌细胞的蛋白酶能选择性地酶解异常蛋白质，包括外源蛋白。解决方案：外源蛋白在周质或胞外表达使用蛋白酶缺陷的菌株低温培养、与分子伴侣共表达消除蛋白酶切割位点、目标蛋白的疏水性修饰,51,结构决定因子：N-氨基酸性质及内部的PEST序列N-端法则：N-端为精aa、赖aa、亮aa、苯丙aa、酪aa、色aa时，蛋白质的稳定性差。N-端附近的内部赖aa是遍在蛋白质的受体，易受依赖于遍在蛋白质的蛋白酶降解。PEST序列：指真核蛋白中富含脯aa、谷aa、丝aa、苏aa的区段，易发生胞内降解，该序列的磷酸化作用增加了与钙离子结合，从而促进依赖于钙离子的蛋白酶的降解。,52,表达部位：周质与胞外所含蛋白酶较少，在这些部位表达的蛋白不易被降解。分子伴侣的稳定作用：阻止聚合作用，促进蛋白质的正确折叠。一种分子伴侣的超量表达无法使蛋白正确折叠，不同类型分子伴侣彼此协调参与蛋白质的折叠。,53,第四节影响真核基因表达效率的因素,54,影响因素：启动子的强度、DNA转录起始序列密码子的选择、mRNA的二级结构转录的终止、质粒的拷贝数及稳定性寄主细胞的生理特征等,55,1.5-UTR对克隆基因表达效率的影响,启动子结构的影响：启动子序列具有2种保守序列，即-35区(5-TTGACA)和-10区(5-TATAAT)。启动子序列与此越相似，其表达能力越强。-35区和-10区之间的距离：也是影响克隆基因表达效率的重要因素。距离越接近17bp，启动子的活性越强。对于某些启动子，-35区上游的10-100bp序列：起上游激活物的作用。,56,启动子与克隆基因之间距离的影响：发生2-3nt长度的变化，就能显著影响翻译的效率。与质粒mRNA5-端的二级结构有关：SD序列或AUG密码子参与mRNA分子的碱基配对会明显降低mRNA的翻译效率。要获得良好表达，AUG密码子或SD序列必须处于易接触的部位，以利于与核糖体结合起始翻译过程。mRNA5-末端与SD序列的距离也是影响翻译效率的重要因素，距离小于15nt时，翻译效率会显著下降。,57,提高克隆基因表达效率的方案：建立克隆库：使目的基因放置在与启动子不同距离的位置上，从重组体中筛选产量最高的克隆。对于表达产物难以测定的基因，可先将其N-端片断与报告基因融合，再建立克隆库，通过报告基因产物的活性来筛选克隆基因有效表达的重组菌落。最后将该质粒中的报告基因用克隆基因的C-端片断替换，即得到高效表达克隆基因的重组质粒。,58,质粒的拷贝数的影响：提高表达效率的途径：增加mRNA的数量。影响mRNA合成速率的因素有两种，即启动子的强度和基因的拷贝数。提高基因的拷贝数：将其克隆到高拷贝数的质粒载体上。质粒的不稳定性的影响：发生质粒丢失保持抗生素的选择压力将质粒分配功能区par克隆到质粒载体上,2.质粒的生物学特性对表达效率的影响,59,对无质粒的细胞进行反选择,60,3.mRNA转录物的分子特性对表达效率的影响,转录起始序列的影响：SD序列的影响：起始密码子上游的5-10nt，核糖体的结合位点。与16SrRNA互补程度越高，转译的效率越高。SD序列后的4个碱基的影响：为4