高效液相色谱仪及固定相、流动相

仪器分析课程讲义仪器分析课程讲义仪器分析课程讲义仪器分析课程讲义 第四节第四节第四节第四节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪 目录目录目录目录目录目录目录目录 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪 高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相 输液系统输液系统 进样系统进样系统 分离系统分离系统 检测系统检测系统 数据处理系统数据处理系统 6.2 6.2 6.2 6.2 高效液相色谱高效液相色谱仪仪 一、输液系统一、输液系统一、输液系统一、输液系统 1 1 1 1贮液器贮液器贮液器贮液器 贮液罐的材料应耐腐蚀，对溶剂呈惰性，贮液罐的材料应耐腐蚀，对溶剂呈惰性，贮液罐的材料应耐腐蚀，对溶剂呈惰性，贮液罐的材料应耐腐蚀，对溶剂呈惰性， 容积约为容积约为容积约为容积约为0 0 0 05 5 5 52 2 2 20 0 0 0L L L L； 贮液罐放置要高于泵体；贮液罐放置要高于泵体；贮液罐放置要高于泵体；贮液罐放置要高于泵体； 使用过程贮液罐应密闭；使用过程贮液罐应密闭；使用过程贮液罐应密闭；使用过程贮液罐应密闭； 溶剂在放入贮液罐之前必须经过溶剂在放入贮液罐之前必须经过溶剂在放入贮液罐之前必须经过溶剂在放入贮液罐之前必须经过0 0 0 045454545umumumum 滤膜过滤。滤膜过滤。滤膜过滤。滤膜过滤。 2 2 2 2脱气装置脱气装置脱气装置脱气装置 作用作用：脱去流动相中的溶解气体。：脱去流动相中的溶解气体。 (1)(1)(1)(1)吹氮脱气法吹氮脱气法吹氮脱气法吹氮脱气法 (2)(2)(2)(2)加热回流法加热回流法加热回流法加热回流法 (3)(3)(3)(3)抽真空脱气法抽真空脱气法抽真空脱气法抽真空脱气法 (4)(4)(4)(4)超声波脱气法超声波脱气法超声波脱气法超声波脱气法 (5)(5)(5)(5)在线真空脱气法在线真空脱气法在线真空脱气法在线真空脱气法( ( ( (onononon1ine degasser) 1ine degasser) 1ine degasser) 1ine degasser) 3 3 3 3 3 3 3 3、 高压输液泵高压输液泵高压输液泵高压输液泵高压输液泵高压输液泵高压输液泵高压输液泵 输送流动相输送流动相输送流动相输送流动相 压力压力压力压力：1501501501501501501501503503503503503503503503501010101010101010 5 5 5 5 5 5 5 5 PaPaPaPaPaPaPaPa 作用作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到：将流动相以稳定的流速或压力输送到 色谱系统。色谱系统。 输液泵的稳定性直接关系到分析结果输液泵的稳定性直接关系到分析结果 的重复性和准确性。的重复性和准确性。 高压泵按其性质可分为高压泵按其性质可分为高压泵按其性质可分为高压泵按其性质可分为恒压泵恒压泵恒压泵恒压泵、恒流泵恒流泵恒流泵恒流泵两类两类两类两类 1 1 1 1 1 1 1 1）往复式柱塞泵）往复式柱塞泵）往复式柱塞泵）往复式柱塞泵： 恒流恒流恒流恒流 泵泵泵泵； 易于更换溶剂，适用于梯易于更换溶剂，适用于梯易于更换溶剂，适用于梯易于更换溶剂，适用于梯 度洗脱但有脉冲波动，可度洗脱但有脉冲波动，可度洗脱但有脉冲波动，可度洗脱但有脉冲波动，可 以加一阻尼器抑制脉冲。以加一阻尼器抑制脉冲。以加一阻尼器抑制脉冲。以加一阻尼器抑制脉冲。 2 2 2 2 2 2 2 2）气动放大泵：）气动放大泵：）气动放大泵：）气动放大泵： 恒压泵恒压泵恒压泵恒压泵 液缸体积大，更换流动相液缸体积大，更换流动相液缸体积大，更换流动相液缸体积大，更换流动相 不方便，不便于梯度洗不方便，不便于梯度洗不方便，不便于梯度洗不方便，不便于梯度洗 脱，脱，脱，脱， 无脉冲、稳定流量的无脉冲、稳定流量的无脉冲、稳定流量的无脉冲、稳定流量的 输出输出输出输出, , , , , , , ,现多用于装柱。现多用于装柱。现多用于装柱。现多用于装柱。 b. b. b. b. b.b. b. b. 高压定量进样阀：高压定量进样阀：高压定量进样阀：高压定量进样阀：（六（六（六（六 通阀进样装置）通阀进样装置）通阀进样装置）通阀进样装置） 优点：进样准确，重现优点：进样准确，重现优点：进样准确，重现优点：进样准确，重现 性好，适于定量分析性好，适于定量分析性好，适于定量分析性好，适于定量分析 c. c. c. c. c. c. c. c.自动进样器：自动进样器：自动进样器：自动进样器：计算机控计算机控计算机控计算机控 制，适合大量进样。制，适合大量进样。制，适合大量进样。制，适合大量进样。 二、进样装置二、进样装置二、进样装置二、进样装置 a. a. a. a.a. a. a. a. 停留进样装置：停留进样装置：停留进样装置：停留进样装置： 缺点：不能承受高压，须停流进样；缺点：不能承受高压，须停流进样；缺点：不能承受高压，须停流进样；缺点：不能承受高压，须停流进样； 无法取得精确的保留时间无法取得精确的保留时间无法取得精确的保留时间无法取得精确的保留时间 三、高效分离柱三、高效分离柱三、高效分离柱三、高效分离柱 色谱柱是实现分离的核心部件。色谱柱是实现分离的核心部件。发展趋发展趋发展趋发展趋 势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 常规液相色谱柱常规液相色谱柱常规液相色谱柱常规液相色谱柱 1 1 1 1 1 1 1 16 6 6 6 6 6 6 6 mmmmmmmmmmmmmmmm，101010101010101050 cm50 cm50 cm50 cm50 cm50 cm50 cm50 cm。 微孔填充柱微孔填充柱微孔填充柱微孔填充柱 0.5-1m0.5-1m0.5-1m0.5-1m0.5-1m0.5-1m0.5-1m0.5-1mmmmmmmmm 毛细管柱毛细管柱毛细管柱毛细管柱 30-5030-5030-5030-5030-5030-5030-5030-50 mmmmmmmm 装柱方法：有干法和湿法，按粒度装柱方法：有干法和湿法，按粒度装柱方法：有干法和湿法，按粒度装柱方法：有干法和湿法，按粒度2020202020202020mmmmmmmm 划分。划分。划分。划分。 柱温控制柱温控制 下列几种情况需要控制柱温：下列几种情况需要控制柱温： 法定标准分析方法中，要求保留时间具法定标准分析方法中，要求保留时间具 有再现性；有再现性； 必须通过改变柱温来提高分离效率；必须通过改变柱温来提高分离效率； 对高分子化合物或黏度大的样品；对高分子化合物或黏度大的样品； 对一些具有生物活性的生物分子；对一些具有生物活性的生物分子； 对一些组成复杂的样品，使用二维色谱对一些组成复杂的样品，使用二维色谱 技术。技术。 四、液相色谱检测器四、液相色谱检测器四、液相色谱检测器四、液相色谱检测器 1. 1. 1. 1.1. 1. 1. 1.紫外检测器紫外检测器紫外检测器紫外检测器: : : : : : : : 应用最广，对大部分有机化合应用最广，对大部分有机化合应用最广，对大部分有机化合应用最广，对大部分有机化合 物有响应。物有响应。物有响应。物有响应。 作用原理：作用原理：作用原理：作用原理：被分析试样组分对特定波长紫外被分析试样组分对特定波长紫外被分析试样组分对特定波长紫外被分析试样组分对特定波长紫外 光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关 系遵守比尔定律。系遵守比尔定律。系遵守比尔定律。系遵守比尔定律。 特点：特点：特点：特点： 灵敏度高，可达灵敏度高，可达灵敏度高，可达灵敏度高，可达1010101010101010-9 -9-9-9-9-9-9-9g.mL g.mLg.mLg.mLg.mLg.mLg.mLg.mL-1 -1-1-1-1-1-1-1； 线性范围高；线性范围高；线性范围高；线性范围高； 可用梯度洗脱；可用梯度洗脱；可用梯度洗脱；可用梯度洗脱； 对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感； 不适用于对紫外不吸收的试样；不适用于对紫外不吸收的试样；不适用于对紫外不吸收的试样；不适用于对紫外不吸收的试样； 紫外光不透过的溶剂不能用（苯等）。紫外光不透过的溶剂不能用（苯等）。紫外光不透过的溶剂不能用（苯等）。紫外光不透过的溶剂不能用（苯等）。 2.2.2.2. 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 紫外可见光度检测紫外可见光度检测紫外可见光度检测紫外可见光度检测 器的重要进展；器的重要进展；器的重要进展；器的重要进展； 10211021102110211021102110211021个二极管阵个二极管阵个二极管阵个二极管阵 列，各检测某一特列，各检测某一特列，各检测某一特列，各检测某一特 定波长，无需停流定波长，无需停流定波长，无需停流定波长，无需停流 扫描而观察色谱柱扫描而观察色谱柱扫描而观察色谱柱扫描而观察色谱柱 流出物的各个瞬间流出物的各个瞬间流出物的各个瞬间流出物的各个瞬间 的动态光谱吸收图的动态光谱吸收图的动态光谱吸收图的动态光谱吸收图 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 3. 3. 3. 3.3. 3. 3. 3. 差示折光检测器（差示折光检测器（差示折光检测器（差示折光检测器（differential refractive differential refractive differential refractive differential refractive differential refractive differential refractive differential refractive differential refractive index detectorindex detectorindex detectorindex detectorindex detectorindex detectorindex detectorindex detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中溶液的折光可连续检测参比池和样品池中溶液的折光可连续检测参比池和样品池中溶液的折光可连续检测参比池和样品池中溶液的折光 指数差值。差值与浓度呈正比；指数差值。差值与浓度呈正比；指数差值。差值与浓度呈正比；指数差值。差值与浓度呈正比； 特点：特点：特点：特点： 通用型检测器通用型检测器通用型检测器通用型检测器 ; ; ; ; ; ; ; ; 灵敏度低（灵敏度低（灵敏度低（灵敏度低（1010101010101010-7 -7-7-7-7-7-7-7g.mL g.mLg.mLg.mLg.mLg.mLg.mLg.mL-1 -1-1-1-1-1-1-1） ），不能用于痕量分，不能用于痕量分，不能用于痕量分，不能用于痕量分 析析析析; ; ; ; ; ; ; ; 对温度敏感，要求使用温度恒定对温度敏感，要求使用温度恒定对温度敏感，要求使用温度恒定对温度敏感，要求使用温度恒定; ; ; ; ; ; ; ; 对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。 许多有机化合物，特别是芳许多有机化合物，特别是芳 香族化合物、香族化合物、受紫外光激发受紫外光激发受紫外光激发受紫外光激发 后能够辐射出荧光。后能够辐射出荧光。后能够辐射出荧光。后能够辐射出荧光。 4. 4. 4. 4.4. 4. 4. 4. 荧光检测器（荧光检测器（荧光检测器（荧光检测器（fluorescence detectorfluorescence detectorfluorescence detectorfluorescence detectorfluorescence detectorfluorescence detectorfluorescence detectorfluorescence detector） 高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度( ( ( ( ( ( ( (比紫外检测器高两个数量级，达比紫外检测器高两个数量级，达比紫外检测器高两个数量级，达比紫外检测器高两个数量级，达 1010101010101010-11 -11-11-11-11-11-11-11g.ml g.mlg.mlg.mlg.mlg.mlg.mlg.ml-1 -1-1-1-1-1-1-1 ) ) ) ) ) ) ) ) 高选择性高选择性高选择性高选择性; ; ; ; ; ; ; ; 线性范围窄；线性范围窄；线性范围窄；线性范围窄； 测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂；测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂；测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂；测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂； 对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光 物质；物质；物质；物质； 广泛应用于生物化工、制药、食品和环境广泛应用于生物化工、制药、食品和环境广泛应用于生物化工、制药、食品和环境广泛应用于生物化工、制药、食品和环境 监测中监测中监测中监测中. . . . . . . . 5. 5. 5. 5. 5. 5. 5. 5. 电导检测器（电导检测器（电导检测器（电导检测器（electrical conductivity electrical conductivity electrical conductivity electrical conductivity electrical conductivity electrical conductivity electrical conductivity electrical conductivity detectordetectordetectordetectordetectordetectordetectordetector） 属属属属电化学检测器电化学检测器电化学检测器电化学检测器，是离子色谱法中应用最，是离子色谱法中应用最，是离子色谱法中应用最，是离子色谱法中应用最 为广泛的检测器为广泛的检测器为广泛的检测器为广泛的检测器 作用原理作用原理作用原理作用原理：根据物质在某些介质中电离后：根据物质在某些介质中电离后：根据物质在某些介质中电离后：根据物质在某些介质中电离后 所产生的电导变化来测定电离物质的含所产生的电导变化来测定电离物质的含所产生的电导变化来测定电离物质的含所产生的电导变化来测定电离物质的含 量。量。量。量。 五、五、液相色谱法固定相液相色谱法固定相液相色谱法固定相液相色谱法固定相 1.1.1.1.1.1.1.1.固定相的形状固定相的形状固定相的形状固定相的形状固定相的形状固定相的形状固定相的形状固定相的形状 （1 1 1 1 1 1 1 1）全多孔型）全多孔型）全多孔型）全多孔型 最初由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多最初由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多最初由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多最初由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多 孔球体孔球体孔球体孔球体 100 100 100 100 100 100 100 100mmmmmmmm的大颗粒，表面涂渍固定液的大颗粒，表面涂渍固定液的大颗粒，表面涂渍固定液的大颗粒，表面涂渍固定液 。传质速度慢，柱效低。传质速度慢，柱效低。传质速度慢，柱效低。传质速度慢，柱效低。 现采用现采用现采用现采用1010101010101010mmmmmmmm以下的小颗粒以下的小颗粒以下的小颗粒以下的小颗粒 。 （2 2 2 2 2 2 2 2）表面多孔型）表面多孔型）表面多孔型）表面多孔型( ( ( ( ( ( ( (薄壳型微珠薄壳型微珠薄壳型微珠薄壳型微珠) ) ) ) ) ) ) ) 30 30 30 30 30 30 30 304040404040404040mmmmmmmm的玻璃微球，表面附着一的玻璃微球，表面附着一的玻璃微球，表面附着一的玻璃微球，表面附着一 层厚度为层厚度为层厚度为层厚度为1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2mmmmmmmm的多孔硅胶。的多孔硅胶。的多孔硅胶。的多孔硅胶。 表面积小，传质速度快，但柱容量低；表面积小，传质速度快，但柱容量低；表面积小，传质速度快，但柱容量低；表面积小，传质速度快，但柱容量低； 2.2.2.2.2.2.2.2.液液液液- - - - - - - -固吸附固定相固吸附固定相固吸附固定相固吸附固定相 极性：硅胶、氧化镁、分子筛极性：硅胶、氧化镁、分子筛 等；等； 非极型：高聚物微球、石墨化碳黑、聚合非极型：高聚物微球、石墨化碳黑、聚合 物包裹固定相。物包裹固定相。 结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：粒度：5 5 5 510 10 10 10 mmmm； 3.3.3.3.液液液液- - - -液色谱固定相液色谱固定相液色谱固定相液色谱固定相 惰性载体惰性载体：硅胶，无机氧化物、高分子硅胶，无机氧化物、高分子硅胶，无机氧化物、高分子硅胶，无机氧化物、高分子 聚合物、脲醛树脂等，多为聚合物、脲醛树脂等，多为聚合物、脲醛树脂等，多为聚合物、脲醛树脂等，多为3 3 3 310um10um10um10um的全的全的全的全 多孔微球多孔微球多孔微球多孔微球。 固定液固定液：正相：正相： 氰基柱、胺基柱等氰基柱、胺基柱等 反相反相 : : 烷基柱、苯基柱。烷基柱、苯基柱。 4. 4. 4. 4. 4. 4. 4. 4. 化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相 化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相: : : : : : : : 目前应用最广、性能最佳的固定目前应用最广、性能最佳的固定目前应用最广、性能最佳的固定目前应用最广、性能最佳的固定 相，一般用硅胶作为基体。相，一般用硅胶作为基体。相，一般用硅胶作为基体。相，一般用硅胶作为基体。 a. a. a. a. a. a. a. a. 硅氧碳键型：硅氧碳键型：硅氧碳键型：硅氧碳键型： Si SiSiSiSiSiSiSiO O O OO O O OC C C C C C C C b. b. b. b. b. b. b. b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiSiSiSiSiSiSiSiO O O OO O O OSiSiSiSiSiSiSiSi C C C C C C C C c. c. c. c. c. c. c. c. 硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型： Si SiSiSiSiSiSiSiC C C C C C C C d. d. d. d. d. d. d. d. 硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型： SiSiSiSiSiSiSiSiN N N N N N N N 化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点 （1 1 1 1 1 1 1 1）传质快）传质快）传质快）传质快，表面无深凹陷，表面无深凹陷，表面无深凹陷，表面无深凹陷; ; ; ; ; ; ; ; （2 2 2 2 2 2 2 2）寿命长寿命长寿命长寿命长， 无固定液流失，耐流动相冲无固定液流失，耐流动相冲无固定液流失，耐流动相冲无固定液流失，耐流动相冲 击；击；击；击； （3 3 3 3 3 3 3 3）选择性好）选择性好）选择性好）选择性好，可键合不同官能团，可键合不同官能团，可键合不同官能团，可键合不同官能团 ； （4 4 4 4 4 4 4 4）有利于梯度洗脱；）有利于梯度洗脱；）有利于梯度洗脱；）有利于梯度洗脱； 六、六、六、六、液相色谱法流动相液相色谱法流动相液相色谱法流动相液相色谱法流动相 1.1.1.1.流动相特性流动相特性流动相特性流动相特性 （1 1 1 1）流动相的种类、配比可显著改变组分）流动相的种类、配比可显著改变组分）流动相的种类、配比可显著改变组分）流动相的种类、配比可显著改变组分 分离状况；分离状况；分离状况；分离状况； （2 2 2 2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，）亲水性固定液常采用疏水性流动相，）亲水性固定液常采用疏水性流动相，）亲水性固定液常采用疏水性流动相， 称为正相液液色谱法称为正相液液色谱法称为正相液液色谱法称为正相液液色谱法; ; ; ; （3 3 3 3）流动相的极性大于固定液的极性，则）流动相的极性大于固定液的极性，则）流动相的极性大于固定液的极性，则）流动相的极性大于固定液的极性，则 称为反相液液色谱称为反相液液色谱称为反相液液色谱称为反相液液色谱 。 组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 流动相类别流动相类别流动相类别流动相类别 按流动相组成分按流动相组成分按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；单组分和多组分；单组分和多组分；单组分和多组分； 按极性分按极性分按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性； 按使用方式分按使用方式分按使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗固定组成淋洗和梯度淋洗固定组成淋洗和梯度淋洗固定组成淋洗和梯度淋洗 常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水、酰胺、腈、醇、酮、水、酰胺、腈、醇、酮、水、酰胺、腈、醇、酮、水、酰胺、腈、醇、酮、 酯、醚、烃类酯、醚、烃类酯、醚、烃类酯、醚、烃类, , , , etc.etc.etc.etc. 流动相可分为：流动相可分为：流动相可分为：流动相可分为：底剂底剂底剂底剂及及及及洗脱剂洗脱剂洗脱剂洗脱剂 底剂：底剂：底剂：底剂：决定基本的色谱分离情况；决定基本的色谱分离情况；决定基本的色谱分离情况；决定基本的色谱分离情况； 洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂：调节试样组分的滞留并对几个组分具调节试样组分的滞留并对几个组分具调节试样组分的滞留并对几个组分具调节试样组分的滞留并对几个组分具 有选择性的分离作用。有选择性的分离作用。有选择性的分离作用。有选择性的分离作用。 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 流动相的选择流动相的选择流动相的选择流动相的选择流动相的选择流动相的选择流动相的选择流动相的选择 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。 正相液正相液正相液正相液- - - -液分配分离（液固色谱极性固定相）液分配分离（液固色谱极性固定相）液分配分离（液固色谱极性固定相）液分配分离（液固色谱极性固定相）： 底剂：低极性的溶剂，如正己烷、苯、氯仿等，底剂：低极性的溶剂，如正己烷、苯、氯仿等，底剂：低极性的溶剂，如正己烷、苯、氯仿等，底剂：低极性的溶剂，如正己烷、苯、氯仿等， 洗脱剂：根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚、洗脱剂：根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚、洗脱剂：根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚、洗脱剂：根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚、 酮、醇等。酮、醇等。酮、醇等。酮、醇等。 反相色谱（液固色谱非极性固定相）反相色谱（液固色谱非极性固定相）反相色谱（液固色谱非极性固定相）反相色谱（液固色谱非极性固定相）： 底剂：底剂：底剂：底剂： 水。水。水。水。 洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂： 有机溶剂作为极性调节剂有机溶剂作为极性调节剂有机溶剂作为极性调节剂有机溶剂作为极性调节剂。 4 4 4 4 4 4 4 4 梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱 梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱，与气相色谱中的，与气相色谱中的，与气相色谱中的，与气相色谱中的程序升温程序升温程序升温程序升温一一一一 样，可极大地改善分离效果样，可极大地改善分离效果样，可极大地改善分离效果样，可极大地改善分离效果 在分离过程中按照一定的程序连续改变载在分离过程中按照一定的程序连续改变载在分离过程中按照一定的程序连续改变载在分离过程中按照一定的程序连续改变载 液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的 变化来改变被分离组分的分离因素。变化来改变被分离组分的分离因素。变化来改变被分离组分的分离因素。变化来改变被分离组分的分离因素。 通过梯度洗脱，可缩短分离时间、通过梯度洗脱，可缩短分离时间、通过梯度洗脱，可缩短分离时间、通过梯度洗脱，可缩短分离时间、 提高分辨能力、改善峰形，还可提高分辨能力、改善峰形，还可提高分辨能力、改善峰形，还可提高分辨能力、改善峰形，还可 提高分析精度。提高分析精度。提高分析精度。提高分析精度。 溶剂的组成在溶剂的组成在溶剂的组成在溶剂的组成在15151515minminminmin内，从内，从内，从内，从10101010（V/VV/VV/VV/V） CHCHCHCH3 3 3 3CN-HCN-HCN-HCN-H2 2 2 2OO O O随时间改变至随时间改变至随时间改变至随时间改变至50505050CHCHCHCH3 3 3 3CN-HCN-HCN-HCN-H2 2 2 2O O O O 梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置 外梯度外梯度: : 两台高压两台高压两台高压两台高压 泵，将两种不同极性的泵，将两种不同极性的泵，将两种不同极性的泵，将两种不同极性的 溶剂按一定的比例送入溶剂按一定的比例送入溶剂按一定的比例送入溶剂按一定的比例送入 梯度混合室，混合后进梯度混合室，混合后进梯度混合室，混合后进梯度混合室，混合后进 入色谱柱。入色谱柱。入色谱柱。入色谱柱。 内梯度内梯度: : 一台高压泵一台高压泵一台高压泵一台高压泵, , , , 通过比例调节阀通过比例调节阀通过比例调节阀通过比例调节阀, , , ,将两将两将两将两 种或多种不同极性的溶种或多种不同极性的溶种或多种不同极性的溶种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高剂按一定的比例抽入高剂按一定的比例抽入高剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。压泵中混合。压泵中混合。压泵中混合。 讨论1 用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品， 以某一比例甲醇-水为流动相时，样品容 量因子较小，若想使容量因子增加，较 好的办法是 A 增加流动相中甲醇的比例 B增加流动相中水的比例 C流动相中加入少量HAc D流动相中加入少量的氨水 讨论2 在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动 相，增加甲醇的比例时，组分的容量因 子k与保留时间tR如何变化？ 作业 1.1.1.1.在在ODSODSODSODS柱上，以甲醇为流动相，某组分的分配柱上，以甲醇为流动相，某组分的分配 容量容量k=1.2,k=1.2,k=1.2,k=1.2,如以乙腈为流动相，其如以乙腈为流动相，其k k k k值是增加值是增加 还是减少，为什么？还是减少，为什么？ 2.2.2.2.在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留 时间是时间是30min30min30min30min，如果改用四氯化碳或乙醚为流，如果改用四氯化碳或乙醚为流 动相，试分析该组分的保留时间如何变化？动相，试分析该组分的保留时间如何变化？ 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种 试样？试样？试样？试样？ 人干扰素人干扰素人干扰素人干扰素- - - - - - - -等电点等电点等电点等电点8.58.58.58.58.58.58.58.5 底剂：底剂：底剂：底剂：5050505050505050mmolmmolmmolmmolmmolmmolmmolmmol/L /L /L /L /L /L /L /L 磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，pH8.0pH8.0pH8.0pH8.0pH8.0pH8.0pH8.0pH8.0 洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂： 5050505050505050mmolmmolmmolmmolmmolmmolmmolmmol/L /L /L /L /L /L /L /L 磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，pH8.5pH8.5pH8.5pH8.5pH8.5pH8.5pH8.5pH8.5，1mol/L 1mol/L 1mol/L 1mol/L 1mol/L 1mol/L 1mol/L 1mol/L NaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaCl 2 2 2 2 2 2 2 2）离子交换色谱流动相）离子交换色谱流动相）离子交换色谱流动相）离子交换色谱流动相）离子交换色谱流动相）离子交换色谱流动相）离子交换色谱流动相）离子交换色谱流动相 组分保留值可通过流动相中组分保留值可通过流动相中组分保留值可通过流动相中组分保留值可通过流动相中盐浓度盐浓度盐浓度盐浓度及及及及pHpHpHp