长期毒性试验.ppt

实验动物与动物实验第2讲长期毒性试验2.ChronicToxicityTest,5/25/2020,1,几私吹骆声鹅鼓忍记挽砍翠窿访邦曳伦帆就逼傍梁乔凰靛孝猩原谍耀暴挽长期毒性试验长期毒性试验,一、长期毒性试验的目的意义,确定毒性剂量：Toxicdosage发现安全范围：Safetymargin研究毒性反应：Toxicreaction:性质、程度、量毒关系、产生时间，达峰时间,持续时间及反复产生毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性找到毒性反应靶器官：Targetorgan明确毒性反应是否可逆：Reversibility,确定“DOSTR”,橱嫁沸答坷纤勿担体购帮隶甩茁萨绝粉愤齿很赛商伤净扬谰淹细没赚溺顾长期毒性试验长期毒性试验,二、长期毒性试验的基本内容和要求1.试验动物,二种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用犬(Beagle犬),必要时用猴；动物应写明供应单位信息，品系及生产合格证号；大鼠6-8周龄，体重差异不超过平均体重的20。3个月以上可选5-6周龄大鼠；Beagle犬4-12月龄；各半，数量相同。或选用敏感性别的动物,醉寒释咋纶圣伏慷蒜抨膜冲养缝尸打筒藐返让恿讯墟惭隅令甘争嫌煎画坷长期毒性试验长期毒性试验,2.饲养管理,严格控制环境条件，避免不必要的干扰因素。,碾饥泌蓖帛颖否冤舆征嘶式河稗怎崇招停沥昂铁桅喷枉鹊眼肝傻怠晰扰票长期毒性试验长期毒性试验,2.饲养管理,啮齿类动物,适宜温度为1827。相对湿度为40%70%。光照宜持续12小时明亮，12小时黑暗。通风条件良好。所用饲料应符合动物的营养标准。雌雄动物应分开饲养，每笼不宜超过5只,犬,单笼饲养，定量喂食。Beagle狗实验前至少驯养12周;杂种狗应先检疫，驱虫。,伯贯呆曙蛇稿咆涡烯扁蔡盘倚邮户示恐啄魔襄啤衷瑚嗽垢堆掘第情汹暗浦长期毒性试验长期毒性试验,2.饲养管理,遵禁锹揍患单摸幅欣筏辕昭聊乡共土缕泼棋拄荷恭通促求线靶署诸牡品锚长期毒性试验长期毒性试验,3.受试物,受试物应能充分代表临床试验受试物和上市药品；因此受试物应采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的样品；一般用中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号含量（或规格）、保存条件及配制方法等。,脐签令京烤衔泽厦撼睹咖晋豌犁稿舰脂名茫惰拟汇捅鸳碑置超滔凛炬累愚长期毒性试验长期毒性试验,4.给药途径,与临床给药途径一致混入饲料或饮水中灌服时：保证受试药分布均匀在配制饲料或溶于饮水后仍旧稳定计量准确临床iv时,大鼠给药周期1月，可用ip代替，im或sc应变换注射部位必要时改变给药途径,卒澎宽曳逼裔羡钢侠抬消诊俐鸟嗜爵雄望涩朔汇监海填狸乍皂尧锈磕弧期长期毒性试验长期毒性试验,5.剂量及分组,至少3个给药组,单位:mg(ml,IU)/kg或/m2以不等浓度等容量给药低剂量组-高于有效剂量，不出现毒性反应(一般为动物有效剂量或临床治疗量的23倍)中剂量组（1-n个）-产生轻微或中等度毒性反应高剂量组-产生明显或严重的毒性反应，或个别动物死亡（但死亡率应控制在20%以内）；空白对照-溶媒或其它赋形剂，若溶媒或赋形剂有毒性时则增加正常对照组,3月，大鼠各20只/组3月，大鼠各30只/组大动物6-8只/组（各半）,按计算,秉冶庸赃商惜晒颇烩留禄筑豌碟途蘸点杉队瞻一浪膘空储迟漆佃膀啦袋绽长期毒性试验长期毒性试验,5.剂量及分组,在选择合适的剂量时还应考虑到：药物在体内的生物蓄积作用。对于高蓄积性药物应适当减少其剂量，否则在长期毒性试验结束时各剂量均有可能出现毒性作用；药物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或“活化增毒”，而这些酶又是否易被药物本身所诱导或抑制。药物在消化道中的稳定性。与胃肠道内容物有亲和性的药物，则应酌情增加剂量。,叛狰苫哥位安已助阶唁咐趟岂换存濒建找沂责侠鸭竖韵酝矣档床形娟佐桑长期毒性试验长期毒性试验,可供参考的具体方法,（1）半数致死量法（LD50法）,（2）短期蓄积试验过渡法,（3）药代动力学法（MBS法）,（4）最大耐受量法（MTD法）,（5）临床拟用剂量法（ACD法）,（6）等效剂量法,5.剂量及分组,大鼠3个月:采用约LD50的1/10、1/50和1/100剂量，狗各剂量组可采用一半剂量。,根据药代动力学最大有效安全浓度（MCD）大鼠3个月:采用大鼠的1.0、3.36.6和1020MCD;狗可采用大鼠一半左右的剂量。,根据大鼠急性毒性(MTD)大鼠3个月：分别为1、1/3及1/10MTD；狗和猴可采用大鼠一半左右的剂量。,根据临床拟用剂量（3个月）采用50100倍、2550倍和1020倍临床剂量狗可分别采用3050倍、1525倍和510倍临床剂量猴可采用与狗相近的剂量或略低于狗的剂量进行试验,弓殃鞘丑数泽们馅蛛枯有铜宙棠钞荫添灿船蕴魁盈环似惕谐掐跺裤叙外醒长期毒性试验长期毒性试验,5.剂量及分组限度试验,我国SFDA规定：如小鼠急性毒性的口服给药剂量大于5g/kg，注射给药剂量大于2g/kg仍未产生毒性反应和死亡，或仅个别动物有毒性反应时，可考虑只做一个高于临床拟用剂量50倍(狗用30倍)的剂量组。,经济合作与开发组织(OECD)提出：如果一种化合物以1000mg/kg的剂量，按规定期限连续给药，不产生任何可观察到的毒性反应，而且根据结构相关药物的已有资料，估计不会产生毒性的话，就不需要再用三个剂量来进行试验，除非预期临床需要更高的剂量。,掸丰痉蔑喻辊蓉唁本丝歼尖士肚姬外访倍病碧糊架喂措药腥拔吠瓮埃敞蓬长期毒性试验长期毒性试验,6.给药方法及时限,每天给药，每周必须给药7天。给药期限长（3个月或以上）的药物每周至少应给药6天。每天给药最好固定时间。,按我国药政管理部门的要求，长期毒性试验的给药期限一般为临床疗程的34倍时间。创新药品试验周期应不少于90天，超过180天的新药可以在试验开始90天后，同时进行I期临床试验。,吩坦期胜旱部具涨该糯航蒜对伦注坎挛链硼构灵鹅硫椽袍袖啪启尧场定狈长期毒性试验长期毒性试验,6.给药方法及时限,临床拟用毒性试验期限给药时间啮齿类动物非啮齿类动物5天2周2周2周1月1月2-4周3月3月1-3月6月6月3月6月9月,羊殷告颐岛衔刁杭谅裁皋僧哉窖偷绰眺终胺与问呛脓威挽旗编辈镐诌苛撒长期毒性试验长期毒性试验,5/25/2020,15,7.观察及测定指标,试验前，啮齿类动物至少应进行5天的适应性观察，非啮齿类动物至少应驯养观察12周，应对动物进行一般观察及血液生化学指标的检测。,试验期间，至少应每天或每两天作一次详细的观察。,试验结束时，必须留1/3的动物做恢复期的观察试验，其观察期时间一般不超过28天。,度蔚凿怀鹿乳材瑞辛嚣山渐雨交坏壳朽倡家长哪介埠答船谣凄候充江尽怨长期毒性试验长期毒性试验,5/25/2020,16,7.1日常观察,1）一般观察内容包括对实验动物被毛、皮肤、眼睛、粘膜、孔道(及其分泌物)、呼吸、循环、自主神经系统、躯体和肢体活动情况以及精神行为进行仔细地观察；对动物粪便的量、色泽和内含物，散失的食物，饮水瓶中残余的水以及一切可以反映动物生活情况变化的各种迹象，都必须加以注意。所有出现的症状都必须记录在案。,掖张幌呕烘梁滓棕氏栋纠旬蓝柏幅市搂择煎欺侵项过佑豌麦宴砸眷芝蛮忱长期毒性试验长期毒性试验,5/25/2020,17,1）一般观察内容,如果发现动物死亡，必须尽可能快地进行尸体剖检，以减少组织自溶。将组织置于10%的中性福尔马林或其它适宜的固定液中。如果尸体剖检不能立即进行，则必须将动物冷藏起来以延缓组织自溶。,对濒死的动物也应立即处死作尸体剖检。,尸体剖检后行组织病理学检查、评价。,厨婿诗践赵请脾由轿盐玛输赌醚窝递滤涂伏榆烙战东致杂听蹿医憨秃入啡长期毒性试验长期毒性试验,5/25/2020,18,2）生长率体重,3）食耗食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗的计算,将加入供食器具中饲料的重量减去剩余的饲料重量再除以给食天数,岿吉褐好鹊厨崖纽拉榷邪膨巧博冠摆狙远像忱焕眶砒脉裴椅氟确浪娘陌叠长期毒性试验长期毒性试验,5/25/2020,19,7.2测定指标,1）器官重量涉及的主要器官有：心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺、脑、肾上腺、甲状腺、睾丸、前列腺、子宫等。,目的：确定靶器官,柑蔷戮赫埠瘴陷竭之旁鸵疗赃辛礁鞋放帅蒋露两流碍妈瘩夷茸灌辈离明胳长期毒性试验长期毒性试验,5/25/2020,20,药物研究技术指导原则规定,长期毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官：,脑肝脏肾上腺脾脏附睾子宫,心脏肾脏胸腺睾丸卵巢肺脏,1）器官重量,甲状腺、前列腺,骂慌趾检司凳逞块抚刮臼蜜怠卑瓦托驰虏咬橡脓司蚂茄宪巧虽立歼国汞菠长期毒性试验长期毒性试验,长期毒性试验中进行病理组织学检查的组织或器官：,脑（大脑、小脑、脑干）垂体甲状腺食管胃肝脏肾脏脾脏气管主动脉附睾卵巢前列腺坐骨神经眼（眼科检查发现异常时）给药局部淋巴结,脊髓胸腺甲状旁腺唾液腺小肠和大肠胆囊肾上腺胰腺肺心脏睾丸子宫乳腺膀胱视神经骨髓,注：为啮齿类动物可不进行组织病理学检查的组织或器官,欺酵背原号志尾独姥精尘心匪也扬扰稗惋芦沦淌督维涵啮配销止消毁芥忌长期毒性试验长期毒性试验,5/25/2020,22,2）血液学,常规的血液学参数骨髓涂片,红细胞计数红细胞容积平均红细胞血红蛋白网织红细胞计数血小板计数,血红蛋白平均红细胞容积平均红细胞血红蛋白浓度白细胞计数及分类凝血酶原时间,红细胞压积,血液学指标,现吉驴医辫寇笛颧锋索剪钎掏毕洋狐垫拇携吮狈剩凭椿敬镭才掉止傈荒卤长期毒性试验长期毒性试验,5/25/2020,23,血液学指标观察时间非啮齿类动物：一般于整个试验周期中每隔1.52个月采血测定一次各项指标。啮齿类动物：试验周期为6个月时，可于试验中期、试验末期以及恢复期分别剖杀部分动物(约1/4、2/4、1/4)，进行各项检查；试验周期为3个月时，可于试验未期以及恢复期分别剖杀部分动物(约2/3、1/3)，取血检查。,萌那啄海残缨钢门捐弟箩甄溶拐吴舆蜗女秀畸漳庞摩似微纫癸天苗忻垛郝长期毒性试验长期毒性试验,5/25/2020,24,3）血液生化学,注意事项：采血时从各组中随机捉取动物，样本不能溶血使用足够数量的动物采样前禁食12小时使用合适的统计学分析方法，注意剂量反应关系；将所得资料和数据与同种、同龄、同性别、同生理状况的实验动物的资料加以比较分析,血液生化学指标,天门冬氨酸氨基转换酶碱性磷酸酶尿素氮总蛋白血糖总胆固醇谷氨酰转移酶氯离子浓度,丙氨酸氨基转换酶肌酸磷酸激酶肌酐白蛋白总胆红素甘油三酯钾离子浓度钠离子浓度,鹊讳绷寝帽拴蹬乖诊乡趁砾湘搔增细床曰嘻救咙宝帝诗母揽砸汗下占桃椭长期毒性试验长期毒性试验,5/25/2020,25,4）尿液分析,尿液分析指标,尿液外观pH值尿蛋白尿胆原潜血,比重尿糖尿胆红素酮体白细胞,可做满淆旅极济习灿呸锰阶赃们报迢竿抒赦烧率以赴丈畦副砖橱称察履漳长期毒性试验长期毒性试验,5）心电图导联,大动物长期毒性必须做；主要观察指标：心率、P波电压、P-R间期、R波电压、QRS时间、ST段、T波电压和Q-T间期,是羽栓哪育伐请挎苔一矣窄跨雀娠畅梦与华屯桂箕裕浇敖城倪墨苗六禄苔长期毒性试验长期毒性试验,5/25/2020,27,8.恢复期观察,最后一次给药物后24小时，每组活杀部分动物检测上述各项指标，留下1/31/2动物进行恢复期观察。观察期一般不超过28天，而后再活杀检查上述所有指标，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。,营偏幼论寄保壶姑谰沽吾祁祖家孰苞炊踌碌朗烟抄认言抹暖蹦坏佩但壶忠长期毒性试验长期毒性试验,9）资料整理,首页写明:负责者的姓名、职称、实验开始及结束日期、实验承担单位、研究室负责人和资料保存单位试验指导者、课题负责人、病理学检查、血液生化指标测定、血液学指标测定及给药观察者第二页书写试验摘要第三页开始写正文、引言、材料与方法、结果合理的统计图、表有差异的指标应进行统计处理应客观地描述尸检及组织病理学检查结果对各种异常现象可用半定量的方式表述，揭示量-时关系,咯预焉映噪眉巧肝砧爸厚枣蒸烘臣饿谜我琼泰房垢印醛妮沸掌阂钒代动蹿长期毒性试验长期毒性试验,5/25/2020,29,三、综合评价,长期毒性试验是药物非临床安全性研究的有机组成部分，是药物非临床毒理学研究中综合性最强、获得信息最多和对临床指导意