QPCR原理ppt课件

兼顾速度与可靠性EppendorfPCR系统,20YearsofPCR,KaryMullis,PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。它最大的特点就是能不断推出新形式。摘自MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow,Denaturation94C,Annealing55C,Elongation72C,Pol,Pol,PCR,5,3,5,3,Separationofstrands,Annealingofprimer,Elongationbypolymerase,PCR后分析结果,PCRproductsindifferentsizes,3kb500bp300bp,为什么终点法定量不准确?,同一样品尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。,典型的PCR四阶段,半对数图谱,线性图谱,平台期,典型的PCR四阶段,线性增长期,基线期,指数增长期,PCR理论方程,lgDNA,循环数,线性期,平台期,y=x(1+e)n,指数期,N=N0 x(1+e)n,N:产物分子数N0:起始分子数e：扩增效率n:循环次数,PCR理论方程只在指数期成立,PCR指数增长期的规律,PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：Yn=X(1+E)n0E1其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，X为n-1个周期后PCR产物的分子数量。等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.,定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指数扩增期;而定性PCR测定的测定点则多为PCR扩增的平台期,为什么终点法定量不准确?,同一样品尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。,Ct(ThresholdCycle)-Thecyclenumberwherethereactionfluorescenceexceedsbackgroundfluorescence.,Cycle#,Fluorescence,Threshold,Threshold-Thepeakofbackgroundfluorescence,asdefinedbytheplatformortheuser.,AmplificationPlot,定量分析原理,Yct=X(1+E)n=2nXEct=1,CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。CT值与起始模板浓度成负相关关系,不同CT值的模板起始浓度相差2n倍,n为CT间差值,为什么CT值起始DNA浓度?,当循环次数n=CT值时：,RCT=RB+X0(1+e)CTRslg(RCT-RB)=lgX0+CTlg(1+e)+lgRsCTlg(1+e)=-lgX0+lg(RCT-RB)lgRs,即CT=-klgX0+b（线性方程）,Rn=RB+X0(1+e)nRs,定量PCR的实质,模板定量找到PCR的指数增长期定量数据归一化,real-timePCR应用范围,科研的主要工具mRNA与基因表达的研究DNA拷贝数的检测单核苷酸多态性（SNPs）的测定DNA芯片结果认证医学方面应用前景更是令人鼓舞极微量的基因表达定量病原体检测,绝对定量,通常用标准品作为外参照制作标准曲线.注意保持与目的基因的同源性,标准曲线的制作,什么是阈值,基线,阈值,标准偏差,基线信号的标准偏差x10,基线阈值CT值,20-19-18-17-16-15-,CT,A,B,C,CT161819,Absoluteamount50,000copies12,500copies6,250copies,SampleASampleBSampleC,标准曲线方法,通过CT值测定起始DNA量,浓度增加1倍，CT值减小1个单位浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位,相对定量,Sample,Nontreatedsample,2-Ct=ChangeinExpressionLevel,GeneofInterest,相对定量,DCt=9.70,DCt=-1.7,DCt=target-ref,DCt=target-ref,Difference=DCt-DCt=DDCt=9.70-(-1.7)=11.40,-2-Ct=-2(Ctarget-Ccalibrator)-(Ctarget-Ccalibrator),DNA芯片结果复证,DNA甲基化检测,BeforeBisulfiteTreatment:Wild-TypeDNA5.GCGGACCGCG.AfterBisulfiteTreatment:UnmethylatedDNA5.GUGGAUUGUG.MethylatedDNA5.GCGGAUCGCG.,高通量SNP筛查,AmplifluorPrimer(UniPrimer),Quencher,PCR,SNP,RealTimePCR技术的诞生,1992年，HiguchiR等第一个报导了实时定量PCR技术HiguchiR,FocklerC,etal.KineticPCRanalysis:real-timemonitoringofDNAamplificationreactions.Biotechnology,1993,11(9):1026-1030.,所谓实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号累积实时监控整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.,实时定量PCR技术是PCR技术和荧光检测技术的结合,FluorescentDyes荧光分子或荧光染料,Exitationpeak,Emissionpeak,Reaction,AmplificationPlot,Time(Cycle#),Fluorescence,荧光信号累积与扩增曲线,荧光分子或染料的检测方法,荧光分子内参式检测（DNASpecificDyes）SYBRGreenI荧光标记的特异探针水解探针:Taqman杂交探针:FRET（DualProbes）分子信标:MolecularBeacons荧光标记引物:Scorpion和Amplifuor其它类:BDQZyme,DNAspecificDyese.g.SYBRGreenI,SYBRGreenI的检测原理,熔解曲线分析引物二聚体,Primerdimers,ProductofInterest,UNG预防污染,UNG酶的作用原理是降解含有dU的双链或单链DNA。它在50C激活，95C灭活.用于预防非特异性PCR扩增和污染。,在定量PCR开始前增加50C的保温步骤，UNG酶即可将已有的PCR产物降解破坏，防止可能造成的污染,仪器热启动,Innovativetechnicalfeaturefordevice-supportedHotStartPCRPerfectcombination:MastercyclerepSandHotMasterEnhancesthePCRtonearlythemaximum,脉冲PCR=超快的升温速度+极大缩短初始升温所需时间,6C/sec,8C/sec,TaqMan探针法的核心:利用Taq酶的53外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号FRET荧光共振能量转移FluorescenceResonanceEnergyTransfer,TaqMan探针原理,Reporter,Quencher,Real-TimeQPCR常用染料,TaqMan探针原理,多探针的反应体系,TwoormoreProbesandDyesinoneTube,Target1,Target2,微卫星系统,Mastercyclerep-新一代PCR仪的代表,超快的升/降温速度,脉冲PCR,独立直观的控制面板,ESP电子样品保护热盖,Mastercyclerep系列-多种模块选择,铝块,铝块,银块,Eppendorf在定量PCR领域厚积薄发,Mastercyclereprealplex实时定量PCR仪的开发秉承了Eppendorf既往的经验.是将经验融入最新技术的精品之作回顾Eppendorf60年的发展历史，当之无愧为高品质实验室仪器的供应商。Eppendorf拥有55年生产光学仪器的经验，近10年来，热循环仪已成为Eppendorf产品家族中的重要组成。,real-timePCR仪器构造,Exitationlightsource,Filter,Detector,热循环仪,光学元件,软件分析,Mastercyclereprealplex,A4-colourdetectionunitinaspacesavingdesign,ThermalModule,SlidingOpticsModule,Mastercyclerep升级为定量PCR仪,epGradient/S,两通道epRealPlex2,四通道epRealPlex4,六通道epRealPlex6,COMINGSOON!,在Mastercyclerep梯度PCR的基础上，整合一个可靠而高度灵敏的光学检测系统，就构成了最新的Mastercyclereprealplex实时荧光定量PCR系统。,Mastercyclereprealplex-模块化设计,A.Mastercyclereprealplex296LEDArrayexcitationat470nm1channelphotomultiplier(CPM)2detectionwavelenghts:520nmand550nm,B.Mastercyclereprealplex496LEDArrayexcitationat470nm2channelphotomultipliers(CPM)4detectionwavelengths:520nm,550nm,580nm,605nm,TwoThermomodulesAluminumblock(epgradient):4C/sheating,3C/scoolingSilverblock(epgradientS):6C/sheating,4.5C/scooling,impulsePCR,Mastercyclereprealplex2：光路特征,96LEDArray,CPMDetector,每个CPM上带两个滤光片,96孔激发模式,由96个LED（光电二级管）组成的光阵列，依一种一一对应的关系将每个反应管中的荧光染料激发，SYBRGreen,FAM,VIC,TET,HEX,ROX,JOEandTAMRA优点:设计紧凑，无可移动部件低能耗,无光密度损失相对于传统的卤素灯，寿命更长,检测器-通道式光电倍增管,相对于传统的光电倍增管，新颖的通道光电倍增管（CPM）结构更坚固，更不易被磁场所干扰快速数据获取:15秒检测4种染料,RTCCDiCycler,CooledCCDABI7000,ABI7900,7300,PMTRotoGene,Sensitivity,CPMrealplexep,敏感性,-Photoncascadecreatesexponentialsignalamplification-“Gain”ofPMTadjustsstrengthofamplification,hv,e-,e-,CCDvsPMT检测性能对比,CCD无法克服检测的边缘效应,快速qPCR新理念,非常快速的温度控制速度，配合快速的检测、直观的编程与软件分析，缩短了实时定量PCR的整体时间。兼顾速度与可靠性,优化参数实现快速PCR,试剂与耗材均为开放,快速QPCR的实现,主要因素:快速升/降温Heatingrate:6oC/sCoolingrate:4.5oC/sonaverage,atimesavingof15-20min.减少holding时间快速数据获取减少反应体积,MasterCyclerepRealPlexSoftware,MastercyclereprealplexSoftware,Thesoftwareofferthefollowingpossibilitiesforevaluatingorviewingtherecordeddata:RawdataAbsoluteQuantificationRelativequantificationMeltingpointdeterminationEndpointdetermination+/-assaysgeneidentificationfluorimeterOnlineanalysisofrawdataastheyappear,Software-AbsoluteQuantification,SoftwareModules:PlateLayoutforAbsoluteQuantification,Redboxes-standards,Blueboxes-unknowns,Yellowboxes-“-”control,Chooseadye,AutoSeriesfunction,Creatingdilutionseriesforabsolutequantificationiseasilydoneusingthe“AutoSeries”function,Mastercyclereprealplex-Software,Usercancreatesubassaystoperformdifferentexperimentsinthesameplate,providedthattheexperimentssharethesamePCRprotocol.,Mastercyclereprealplex-Software