17.微生物学在药学中的应用

生命科学与技术学院 徐 旭 东 生命科学与技术学院 徐 旭 东 xu_xudong 微生物在药学中的应用微生物在药学中的应用 Pharmaceutical Microbiology 1. 重视新的筛选模型和方法的设计；重视新的筛选模型和方法的设计； 2. 扩大微生物代谢产物的研究范围；扩大微生物代谢产物的研究范围； 设计到酶抑制剂、免疫条件剂、降血脂药物、抗寄生虫药物等等。 3. 重视新菌种的资源开发；重视新菌种的资源开发； 重视稀有放线菌、海洋微生物和极端微生物的开发。 4. 新技术的大量应用。新技术的大量应用。 主要有分离技术、光谱分析、高通量筛选和计算机检索等。 一、现代微生物药物研究的新特点一、现代微生物药物研究的新特点 二、工业发酵的菌种和发酵方式 （一）生产菌种的要求和来源 二、工业发酵的菌种和发酵方式 （一）生产菌种的要求和来源 能在较短的发酵过程中，高产有价值的发酵产品； 发酵的培养基价格低廉，来源充分，被转化率高； 菌种不具有潜在的危害性； 发酵的副产物较少； 菌种遗传特性稳定。 1. 生产菌种的要求生产菌种的要求 从自然环境筛选, 再进行人工诱变育种； 购买。 2. 生产菌种的来源生产菌种的来源 样品三角瓶悬液试管稀释平板分离样品三角瓶悬液试管稀释平板分离 挑选单菌落挑选单菌落液体发酵液体发酵 从自然环境筛选菌种的流程从自然环境筛选菌种的流程 发酵产量分析诱变发酵产量分析诱变平板分离平板分离 放大和生产放大和生产 多次重复多次重复 （二）大规模发酵的方式（二）大规模发酵的方式 对氧气的需求对氧气的需求 好氧发酵 厌氧发酵 好氧发酵 厌氧发酵 培养基形态培养基形态 液体发酵 固体发酵 分批发酵 连续发酵 游离发酵 固定化发酵 纯种发酵 混和发酵 液体发酵 固体发酵 分批发酵 连续发酵 游离发酵 固定化发酵 纯种发酵 混和发酵 发酵连续性 微生物细胞 与载体关系 菌种种类 发酵连续性 微生物细胞 与载体关系 菌种种类 工业发酵工业发酵 抗生素（Antibiotic）是生物在其生命活动过程中产生 的（或用化学、生物、生物化学方法衍生的），能在低微 浓度下有选择性抑制或影响它种生物功能的有机化合物。 一、抗生素的概念和分类一、抗生素的概念和分类 第一节 抗生素第一节 抗生素 （一）抗生素的概念（一）抗生素的概念 1929年，Fleming首先从青霉菌中发现青霉素； 1944年，Waksman在链霉菌中发现链霉素。 自本世纪40年代以来，已找到上万种新抗生素，合成了近10万种半 合成抗生素，但其中在临床上常用的仅100余种。 （二）医疗用抗生素的特点（二）医疗用抗生素的特点 1差异毒力差异毒力 2生物活性强、由不同的抗菌谱；生物活性强、由不同的抗菌谱； MIC（minimal inhibitory concentration）：能抑制微生物生长所需 的药物的最低浓度。 MBC（ minimal bactericidal concentration ）：也称MLC(minimal lethal concentration)； 3不易产生耐药性、毒副作用小；不易产生耐药性、毒副作用小； 4不易引起超敏反应；不易引起超敏反应； 5吸收快，血浓度高；吸收快，血浓度高； 6不易被血清蛋白结合而失活。不易被血清蛋白结合而失活。 （三）抗生素的分类（三）抗生素的分类 1根据抗生素的产生来源分类根据抗生素的产生来源分类 （1）细菌产生的抗生素 （2）放线菌产生的抗生素 （3）真菌产生的抗生素 （4）植物和动物产生的抗生素 2根据抗生素的化学结构进行分类根据抗生素的化学结构进行分类 （1）-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素 ：青霉素、头孢菌素等。 （2）氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素 ：链霉素、卡那霉素等。 （3）大环内酯类抗生素大环内酯类抗生素 ：红霉素、麦迪霉素等。 （4）四环类抗生素四环类抗生素 ：四环素、金霉素等。 （5）多肽类抗生素多肽类抗生素：多粘菌素、杆菌肽等。 二、抗菌药作用机制二、抗菌药作用机制 1抑制细菌细胞壁合成抑制细菌细胞壁合成： 胞浆内粘肽前体的形成 胞浆膜阶段粘肽合成 胞浆外交叉联接过程 2影响胞浆膜通透性影响胞浆膜通透性； 3抑制蛋白质合成；抑制蛋白质合成； 4抑制核酸代谢（叶酸代谢；核酸合成 ）。抑制核酸代谢（叶酸代谢；核酸合成 ）。 三、抗生素产生菌的分离和筛选三、抗生素产生菌的分离和筛选 土壤微生物的分离 筛选 早期鉴别 分离精制 临床前试验研究 临床试验 四、抗生素的制备四、抗生素的制备 菌种孢子制备种子制备发酵 发酵液预处理提取和精制成品检验成品包装 五、耐药性五、耐药性 耐药性产生机制耐药性产生机制： 产生灭活酶（水解酶；钝化酶）； 改变细胞膜通透性； 细胞内靶位结构改变； 代谢途径改变。 耐药性：多次接触后，敏感性下降，疗效降低或无效。 避免出现细菌的耐药性的措施：避免出现细菌的耐药性的措施： （1）合理使用抗生素； -避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素 -不同的抗生素(或与其他药物)混合使用 （2）筛选新的更有效的抗生素或对现有抗生素进行改造； （3）抗药机制的研究。 第二节 氨基酸发酵第二节 氨基酸发酵 1820年：水解蛋白质的方法开始制造氨基酸； 1850年：化学方法合成了氨基酸； 1956年：Kinoshita利用微生物直接发酵糖类生产谷氨 酸，是现代发酵工业的重大突破，是氨基酸生产方法的 重大革新； 1973年：固定化菌体进行天冬氨酸的工业规模的生产。 一、氨基酸的应用一、氨基酸的应用 食品工业食品工业：食品添加剂、调味剂（味精、aspartame）； 饲料工业饲料工业：饲料添加剂； 医药工业医药工业：氨基酸输液；给药系统（聚谷氨酸苄酯共聚物 等）； 化学工业化学工业：谷氨酸制备洗涤剂（十二烷酰基谷氨酸钠肥 皂）、润肤剂（焦谷氨酸钠）、聚谷氨酸人造革、以及人 造纤维和涂料； 农业农业：制造可被微生物分解的无公害农药。 N-月桂酰-L-异戊氨酸，能防止稻瘟病，又能提高 稻米的蛋白质含量。 二、氨基酸的生产方法二、氨基酸的生产方法 氨基酸的生产方法可分为： 抽提法抽提法：酸水解蛋白质原料，然后从水解液中提取； 直接发酵法直接发酵法：大多数氨基酸可用此法生产； 添加中间产物的转化法添加中间产物的转化法： 酶法酶法：用完整菌体（固定化菌体细胞）或微生物产生 的酶（固定化酶）来制造氨基酸； 合成法合成法。 三、氨基酸产生菌的选育 （ 三、氨基酸产生菌的选育 （1）氨基酸产生菌的来源）氨基酸产生菌的来源 大多数优良的氨基酸产生菌，属于： 棒杆菌属棒杆菌属(Corynebacterium)： Corynebacterium. glutamicum 短杆菌属短杆菌属(Brevibacterium)： Brevibacterium flavum 微杆菌属(Microbacterium)： Microbacterium aminophilum 微球菌属(Micrococcus)： 节杆菌属(Arthrobacter) ： Arthrobacter paraffineus （2）氨基酸产生菌的遗传特点）氨基酸产生菌的遗传特点 营养缺陷型突变株 抗氨基酸结构类似物突变株 细胞透性改变的突变株 （3）氨基酸发酵 机理和菌种选育）氨基酸发酵 机理和菌种选育 1. 氨基酸发酵机理氨基酸发酵机理 葡萄糖葡萄糖 C3糖 丙酮酸 乙酰辅酶 糖 丙酮酸 乙酰辅酶A 草酰乙酸草酰乙酸柠檬酸柠檬酸 -酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸精氨酸精氨酸 脯氨酸脯氨酸 天冬氨酸天冬氨酸 苏氨酸苏氨酸 异亮氨酸异亮氨酸 甲硫氨酸甲硫氨酸赖氨酸赖氨酸 戊糖戊糖C5 四碳糖四碳糖C4 莽草酸莽草酸苯丙氨酸苯丙氨酸 酪氨酸酪氨酸 色氨酸色氨酸 丙氨酸丙氨酸 缬氨酸缬氨酸 亮氨酸亮氨酸 组氨酸组氨酸 TCA 谷氨酰酸谷氨酰酸 丝氨酸丝氨酸 甘氨酸甘氨酸 半胱氨酸半胱氨酸 微生物细胞中氨基酸合成的特点：微生物细胞中氨基酸合成的特点： 某一类氨基酸往往有一共同的前提体； 氨基酸的合成与EMP途径和TCA循环密切相关； 一种氨基酸可能是另一种氨基酸的前体。 微生物细胞中大量积累氨基酸，必须做到：微生物细胞中大量积累氨基酸，必须做到： 解除氨基酸代谢途径的反馈抑制； 防止氨基酸降解或者合成其他相关产物； 增加细胞膜的通透性。 . 氨基酸发酵菌种选育氨基酸发酵菌种选育 赖氨酸发酵生产菌赖氨酸发酵生产菌 产生菌产生菌 谷氨酸棒杆菌 黄色短杆菌 乳糖发酵短杆菌 谷氨酸棒杆菌 黄色短杆菌 乳糖发酵短杆菌 遗传特性遗传特性 高丝氨酸营养缺陷型 抗 高丝氨酸营养缺陷型 抗AEC突变株突变株 谷氨酸发酵生产菌谷氨酸发酵生产菌 产生菌产生菌 谷氨酸棒杆菌 黄色短杆菌 谷氨酸棒杆菌 黄色短杆菌 遗传特性遗传特性 CO2固定能力强； 乙醛酸循环弱； 其他族氨基酸合成减 弱。 固定能力强； 乙醛酸循环弱； 其他族氨基酸合成减 弱。 第三节 维生素发酵第三节 维生素发酵 一、维生素一、维生素C 弱氧化醋杆菌 （ 弱氧化醋杆菌 （Acetobacter suboxydans） 我国发明的两步发酵法我国发明的两步发酵法 重组菌一步发酵法：重组菌一步发酵法：将棒状杆菌的将棒状杆菌的2,5-二酮二酮-D-葡萄糖酸还原酶基因克 隆到欧文氏菌体内，构建基因工程菌来完成从 葡萄糖酸还原酶基因克 隆到欧文氏菌体内，构建基因工程菌来完成从D-葡萄糖直接转化成葡萄糖直接转化成2- 酮基酮基-L-古龙酸的一步发酵法。古龙酸的一步发酵法。 二、维生素二、维生素B2 最常用的生产菌种为棉病囊霉棉病囊霉（Ashbya gossypii）和 阿氏假囊酵母阿氏假囊酵母（Eremothecium ashbyii）。 三、维生素三、维生素B12 能产生维生素B12的微生物有细菌和放线菌，尤其是s 舒氏丙酸杆菌舒氏丙酸杆菌（Propionibacterium shermanii）和菲氏丙酸 杆菌 菲氏丙酸 杆菌（Propionibacterium freudenreichii），酵母和霉菌不 能产生维生素B12。 丙酸细菌进行丙酸发酵的发酵过程丙酸细菌进行丙酸发酵的发酵过程 Glucose Pyr EMP OAAMalFum NADH2NAD H2O Succ NADH2 NAD SuccCoA 甲基丙二 酰CoA 丙酰CoA CO2-BioBiotin 丙酸丙酸 甲基丙二酰甲基丙二酰CoA异构酶异构酶 （VB12为辅基）为辅基） 第四节 甾体化合物转化第四节 甾体化合物转化 甾体化合物甾体化合物（steroid）又称为类固醇，是一类含有环 戊烷多氢菲核（甾体化合物的母核）的化合物。 甾体化合物尤其是甾体激素对机体有重要的调节作 用，因此在医疗上应用十分广泛。 一、微生物转化工艺一、微生物转化工艺 用微生物转化方法生产甾体化合物往往是化学合成路 线中的某一步或两步，转化工艺一般可分为两个阶段：第 一阶段为菌体生长阶段，第二阶段为转化阶段。 微生物转化方法分为三种类型微生物转化方法分为三种类型： 生长细胞转化法生长细胞转化法：将底物加入到微生物培养液中转化； 静息细胞转化法静息细胞转化法：从微生物培养液中制备细胞悬液或干 细胞，将底物加入到菌体细胞悬液中进行微生物转化； 固定化细胞与固定化酶转化法固定化细胞与固定化酶转化法：将培养好的菌体制备成 固定化细胞或固定化酶用于对底物进行转化。 二、微生物转化的反应类型二、微生物转化的反应类型 （一）羟化反应（一）羟化反应 微生物使孕酮在微生物使孕酮在11位羟化形成位羟化形成11羟基孕酮，再经四步化学反 应就能形成可的松。 羟基孕酮，再经四步化学反 应就能形成可的松。 （二）脱氢反应（二）脱氢反应 可的松在可的松在C-1位和位和C-2位之间形成双键后，其生物活性较其母体增强数倍位之间形成双键后，其生物活性较其母体增强数倍 （三）侧链降解反应（三）侧链降解反应 胆固醇胆固醇 ADD 豆甾醇豆甾醇 雄甾烷雄甾烷-1，4二烯二烯-3，17二酮二酮 4AD 4-雄甾烷雄甾烷-3，17二酮二酮 睾丸素睾丸素乙炔睾酮乙炔睾酮 雌酮雌酮 雌二醇雌二醇炔雌醇炔雌醇雌三醇雌三醇炔诺酮炔诺酮 第五节 酶与酶抑制剂第五节 酶与酶抑制剂 一、酶制剂 （一）医药领域常用的微生物酶制剂 一、酶制剂 （一）医药领域常用的微生物酶制剂 1链激酶和链道酶：链激酶治疗脑血栓； 2透明质酸酶：加速扩散，利于药物吸收； 3天冬氨酰胺酶：治疗白血病和某些肿瘤； 4消化酶：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等； 5青霉素酰化酶：在半合成青霉素的生产中具有重要的 作用。 青霉素青霉素G水解制备水解制备6-APA的反应的反应 （二）微生物酶生产菌的筛选和酶制剂的发酵生产（二）微生物酶生产菌的筛选和酶制剂的发酵生产 1. 产酶菌种的筛选产酶菌种的筛选 蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶水解圈 （透明圈法） 其他酶 特定的酶活测定方法（查文献） 2. 酶的发酵生产酶的发酵生产 （1）添加合适的诱导剂； （2）添加产酶促进剂； （3）组成型突变株的选育。 二、酶抑制剂二、酶抑制剂 酶抑制剂酶抑制剂(enzyme inhibitor)主要是微生物产生的一类小 分子生理活性物质，它们能够特异性抑制某些酶的活性。 酶抑制剂具有低毒性、小分子量、结构新颖以及结构 的多种多样性等特点，已被用于增强免疫、生理功能调 节、疾病治疗、治疗抗药菌感染等多个方面。 微生物来源的蛋白酶抑制剂有亮肽剂亮肽剂(Leupeptin)、抗 肽 剂 抗 肽 剂 (Antipain) 、 抑 靡 酶 剂抑 靡 酶 剂 (Chymostatin) 、 抑 胃 酶 剂抑 胃 酶 剂 (Pepstatin)、弹性朊醇弹性朊醇(Elastainal)等。 （一）蛋白酶抑制剂（一）蛋白酶抑制剂 （二）细胞膜表面酶抑制剂（二）细胞膜表面酶抑制剂 微 生 物 来 源 的 细 胞 膜 表 面 酶 抑 制 剂 有 抑 氨 肽 酶抑 氨 肽 酶 B(Bestatin)、抑氨肽酶抑氨肽酶A(Amastatin)、抑脂酶剂抑脂酶剂(Esterastin)。 （三）糖苷酶及淀粉酶抑制剂（三）糖苷酶及淀粉酶抑制剂 微生物来源的糖苷酶及淀粉酶抑制剂有泛涎菌素泛涎菌素 (Panosialin)、异黄酮鼠李糖苷异黄酮鼠李糖苷(Isoflavonoid)、抑唾液酶剂抑唾液酶剂 (Siastatin)、抑淀粉酶剂、抑淀粉酶剂(Amylostatin)等。等。 （四）肾上腺素合成酶抑制剂（四）肾上腺素合成酶抑制剂 微生物来源的肾上腺素合成酶抑制剂有小奥德蘑酮小奥德蘑酮 (Oudenone)、镰孢菌酸镰孢菌酸(Fusaric acid)等。 （五）（五）-内酰胺酶抑制剂内酰胺酶抑制剂 微生物来源的-内酰胺酶抑制剂有棒酸棒酸(Clavulanic acid)、硫霉素硫霉素(Thianamycin)等。 Clavulanic acid produced by Streptomyces clavuligerus, has a chemical structure similar to some -lactamines, e.g. penicillin and possesses the ability to inactivate a wide variety of beta-lactamases (commonly found in microorganisms resistant to penicillins and cephalosporins) by blocking the active sites of these enzymes. The mechanism of action of clavulanic acid 第六节 菌体制剂第六节 菌体制剂 一、药用酵母一、药用酵母 酵母细胞中含有丰富的营养物质，如蛋白质、氨基酸、维生素 等，并含有辅酶 酵母细胞中含有丰富的营养物质，如蛋白质、氨基酸、维生素 等，并含有辅酶A、细胞色素、细胞色素C、谷胱甘肽、麦角固醇和核酸等生理活 性物质以及多种酶类。药用酵母可促进机体的代谢机能，增进食欲， 用于治疗消化不良和维生素 、谷胱甘肽、麦角固醇和核酸等生理活 性物质以及多种酶类。药用酵母可促进机体的代谢机能，增进食欲， 用于治疗消化不良和维生素B族缺乏症。族缺乏症。 二、活菌制剂二、活菌制剂 活菌制剂也被称为微生态制剂，是根据微生态学的原理，利用人 体正常菌群的某些种类，经人工培养方法制成。目前应用较多的活菌 制剂主要使用了 活菌制剂也被称为微生态制剂，是根据微生态学的原理，利用人 体正常菌群的某些种类，经人工培养方法制成。目前应用较多的活菌 制剂主要使用了乳酸菌乳酸菌、双歧杆菌双歧杆菌以及以及肠球菌肠球菌、大肠杆菌大肠杆菌、蜡样芽胞 杆菌 蜡样芽胞 杆菌、酵母菌酵母菌等。等。 微生物药物微生物药物(microbialmedicine)：由微生物产生的具有除抗 感染、抗肿瘤作用以外的其它活性的物质的物质，如酶抑制 剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等。 第七节 微生物药物的研究进展第七节 微生物药物的研究进展 上述化合物是在抗生素研究的基础上发展起来的，均为 微生物的次级代谢产物，其在生物合成机制、筛选研究程序 及生产工艺等多方面具有共同的特点。 一、从抗生素到微生物药物的发展概况一、从抗生素到微生物药物的发展概况 1929年，Fleming发现青霉素； 1941年，青霉素在美国开发成功； 1943年，美国科学家Waksman发现链霉素，提出了一整套较 为系统的从微生物中寻找抗生素的方法。 此后，从放线菌中陆续发现了金霉素、土霉素、四环素 等四环素类抗生素；卡那霉素、庆大霉素、新霉素、妥布霉 素、小诺霉素等氨基糖苷类抗生素和红霉素、吉他霉素、螺 旋霉素、麦迪霉素等大环内酯类抗生素；利福霉素等安莎类 抗生素和制霉菌素、两性霉素B等多烯类抗真菌抗生素也相 继问世。 自60年代起，开始从微生物代谢产物中寻找具有除抗 菌作用外的其它生理活性的物质，抗肿瘤抗生素、抗虫抗 生素、抗病毒抗生素和农用抗生素等。 日 本 科 学 家 梅 泽 滨 夫梅 泽 滨 夫 (Umezawa) 是 继 Fleming 和 Waksman之后，在抗生素研究领域中作出卓越贡献的第三 位科学家。他的贡献除发现了许多临床上有用的抗生素(如 卡那霉素、丁胺卡那霉素、博莱霉素、培罗霉素等)之外， 更为重要的是提出了酶抑制剂的概念提出了酶抑制剂的概念，开创了从微生物代 谢产物中寻找其它生理活性物质的新时代。 1976年，具有显著降血脂作用的胆固醇生物合成抑制 剂HMG-CoA还原酶抑制剂还原酶抑制剂洛伐他丁、普伐他丁以及免疫 抑制剂环孢菌素A、雷帕霉素、FK506等的开发成功； 近年来，各种新的筛选模型的应用，每年继续有约 500种新化合物和一些老化合物的新生理活性被发现，使 微生物药物的研究进入了黄金时期。 从抗生素到微生物药物，半个多世纪中，似乎可以看 到3次高潮次高潮，即50年代大量天然抗生素被发现；第二次是 60年代开始的半合成抗生素的研究和应用；第三次则是近 年来掀起的从微生物代谢产物中筛选非抗生素类生理活性 物质的研究。 二、寻找新微生物药物常用的一些筛选方法二、寻找新微生物药物常用的一些筛选方法 1. 用动物细胞和组织建立的筛选模型用动物细胞和组织建立的筛选模型 抗肿瘤活性物质抗肿瘤活性物质：观察细胞形态的变化，测定体外细胞毒性IC50值。 免疫抑制剂免疫抑制剂：测定对淋巴细胞增殖反应的抑制作用。 神经营养因子样物质神经营养因子样物质：以神经细胞的分化，如以神经轴突的伸长为指 标。 血管平滑肌松弛物质血管平滑肌松弛物质：以大鼠或家兔的胸部大动脉为材料，观察对血 管平滑肌的松弛作用。 血管生成抑制剂血管生成抑制剂：以鸡绒毛膜尿囊膜和动物角膜微囊为材料，观察对 新血管生成的抑制作用。 2. 酶抑制剂的筛选酶抑制剂的筛选 酶抑制剂的筛选和酶活测定相关。 3. 受体拮抗剂的筛选受体拮抗剂的筛选 速激肽速激肽(tachykinin，TK)：以3H标记的P物质与其受体结合的抑制率为 指标。 内皮素内皮素(endothelin，ET)：观察内皮素与其受体结合的抑制率。 缩胆囊素缩胆囊素(cholecystokinin，CCK)：以125I标记的CCK，与其受体结合 的抑制率为指标。 心房纳利尿肽心房纳利尿肽(ANP)：以125I标记的ANP与其受体结合的抑制率为指 标。 兴奋性氨基酸兴奋性氨基酸(EAA)：观察EAA与其受体的结合的抑制率。 白三烯白三烯B4(LTB4)：以人多形核白细胞(PMN)为LTB4的受体，观察其 抑制率。 微生物免疫刺激剂微生物免疫刺激剂 三、微生物药物筛选流程三、微生物药物筛选流程 四、微生物药物的种类和作用领域四、微生物药物的种类和作用领域 五、微生物药物产生菌的种类五、微生物药物产生菌的种类 从利用微生物资源的角度来讲，微生物资源是可再生 的和颇具潜力的。据估计，已知的细菌(包括放线菌)近5000 种，估计自然界存在的细菌有40000种(已知仅占12%)。已 知真菌6万多种，实际可能有100多万种(已知仅占5%)。其 中，已有34属600种放线菌，97属300种细菌和2000属49000 种真菌已用于筛选微生物药物。当然，其中大部分的微生 物还属于难培养微生物。因此，开展难培养微生物的培养 对于发掘微生物资源至关重要。 主要内容：主要内容： 抗生素体内药效； 抗生素的体外药效； 用微生物学方法测定抗生素效价，即含量。 第一节 抗生素的体内和体外药效第一节 抗生素的体内和体外药效 一、体内抗菌试验一、体内抗菌试验 抗生素的体内抗菌试验是以动物如小鼠、豚鼠等作 为感染动物的实验模型。动物感染细菌等致病菌后，观 察给药（抗生素）对动物的保护作用，以半数有效量 ED50表示。 第第20章 药物的体内外抗菌试验章 药物的体内外抗菌试验 （一）实验动物（一）实验动物 选用有实验动物合格证的动物房提供的健康小鼠，体 重1822克，雌雄各半，随机分组，每组动物至少10只。 （二）感染细菌（二）感染细菌 根据所试验药物的抗菌作用特点，选择不同菌株进行 试验，包括革兰阳性菌和革兰阴性菌。 接种的细菌来自新鲜斜面，接种至肉汤培养基培养恒 温一定时间，离心除去培养基后可得到试验用菌体。菌体 用生理盐水洗涤和离心除去吸附于细菌细胞表面培养基和 细菌毒素等。细菌用含5%胃膜素（或干酵母）的生理盐水 稀释至所需浓度，如106、107、108、109、1010cfu/ml等浓 度。 （三）感染过程（三）感染过程 以不同浓度的细菌感染实验动物，测出所试验菌株对动物小鼠致 死的最低浓度，即100%最小致死量（100% MLD），作为感染菌量。 将小鼠随机分组，总数不少于5组，每组10只。以相当于100%最小 致死量的菌液感染小鼠。药物稀释至一定浓度后按等比例，一般于感染 后即刻和感染后6小时，口服、尾静脉注射或皮下注射等方法给药，连 续观察试验小鼠感染细菌和给药后的状况，记录动物死亡数。 试验需设感染相同菌量而不给药的动物阴性对照组，即给等容积的 生理盐水。同时与同类抗菌药物作对比研究，即设阳性药物对照组。 （四）药物的体内药效评价（四）药物的体内药效评价 细菌感染和给药后注意观察动物反应，连续观察7天，记录动物死 亡数，按Bliss法计算各感染菌的药物半数有效量(ED50)及95可信限。 药物的ED50越小，体内药效越高。 二、体外抗菌试验二、体外抗菌试验 体外抗菌试验体外抗菌试验（antimicrobial test in vitro）主要用于筛 选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性，所以也称药敏试 验 药敏试 验，常用最低抑菌浓度（MIC）表示，是指药物完全抑制 某种微生物生长的最低浓度。试验大多在玻璃器皿中进 行，优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。 但是没有体内复杂的因素参与，故体内和体外抗菌试验结 果有时会不一致。 体外抗菌试验必须严格控制试验条件，使其尽可能标准化 。 1.试验菌.试验菌 常选用细菌、霉菌和酵母菌，必要时也选用其他类群 的微生物。一般应包括标准菌株和临床分离菌株。 标准菌株 临床分离菌株 标准菌株 临床分离菌株 来自专门机构，我国是卫生部药品生物制品检 定所菌种保藏中心供应。 Staphylococcus aureus ATCC 25925 Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 临床分离株须经形态、生化及血清学等方面 鉴定。 2培养基培养基 采用灭菌并恒温于45水浴的M-H(Mueller-Hinton agar)培养基培养基，对培养基有特殊要求的细菌可采用其他特殊 培养基，如血平板。 成分：成分： 牛肉膏5g 水解酪蛋白0.5g 可溶性淀粉1.5g 琼脂17g 水1000ml PH 7.4 3供试药物供试药物 4对照试验对照试验 试验菌对照试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长。 已知药物对照已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期 的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。 溶剂及稀释剂对照溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂 应无抗菌作用。 试验用抗生素药物用适当的溶剂溶解（通常为灭菌 生理盐水），倍比稀释至所需药物浓度。 一、琼脂扩散法（agar difussion test） 利用药物可以在琼脂培养基中扩散的原理，基本方法 是将试验菌加入琼脂培养基，混合倾注平板（或用L 棒使试 验菌均匀分布），然后加药于含菌平板上，培养1824小时 后，根据抑菌圈或抑菌范围大小初步判断抑菌作用的强 弱。 1滤纸片法滤纸片法 2打孔法打孔法 3管碟法管碟法 4挖沟法 常用的体外抑菌试验 挖沟法 常用的体外抑菌试验 ChlAmp Ery Str Tet 滤纸片法、打孔法 、管碟法原理上是一样的滤纸片法、打孔法 、管碟法原理上是一样的 含有检测菌的平板含有检测菌的平板 D 抑菌圈抑菌圈 MIC 打孔法的实际结果打孔法的实际结果 4挖沟法挖沟法 常用的体外抑菌试验常用的体外抑菌试