实验中常用蛋白检测方法ppt课件

.,蛋白的检测方法,.,WesternBlot,免疫荧光,ELISA,免疫组化,.,WesternBlot,原理：经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到PVDF膜上（以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变）。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色、化学发光或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。特点：组织、细胞来源均可；半定量,.,原理：抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。特点：是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。,免疫组化/免疫荧光,.,原理：酶联免疫法，它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。特点：免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，需将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。,ELISA,.,3种蛋白检测水平的比较,.,蛋白的交互作用,,.,寻找目标蛋白,.,验证两蛋白间作用,.,验证蛋白交互作用方法,经典的方法有：CO-IPGST-pulldown酵母双杂交系统,.,CO-IP，又叫免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Z也能沉淀下来。目前多用proreinA预先结合固化在琼脂糖微珠上，ProteinA是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体的Fc区结合，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，琼脂糖微珠上的proreinA/G与抗体Fc特异性结合，由于抗体抗原特异性，沉淀蛋白X；溶液中有和蛋白X相互作用的物质，就能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。,.,.,Pull-down实验,跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。要证明直接的结合就是Pull-down实验。提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。,.,研究某分子A在椎间盘退变中作用椎间盘标本切片