细胞转染ppt课件VIP

.,细胞转染,细胞转染技术：指将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。它是研究基因表达调控、突变分析、蛋白质生产等的常规工具。,常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染两大类。,瞬时转染：,指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合在细胞的染色体上。,稳定转染：,DNA整合到宿主细胞的染色体中。,瞬时转染,该方法是通过一定的转染程序将含目的调控区的质粒导人培养细胞。在典型情况下，调控区调控“报告基因”的转录。报告基因是在mRNA和蛋白质的水平上都易于被正确检测到的基因。产生的质粒在培养细胞中转录后，在特定时刻测定从报告基因上合成的mRNA或蛋白质，以评价调控区的活性。人们将这种分析方法称为瞬时转染分析。此时质粒仍然以附加的形式存在，很少整合进宿主基因组。因此，mRNA或蛋白质产物必须在短时间内(13天)进行测定，否则随着细胞的生长和分裂，质粒会被降解或稀释。虽然瞬时转染分析法具有多种局限性，但该方法仍然常用于对顺式作用DNA序列和调控基因表达的反式因子进行初步分析。,瞬时转染,优点：瞬时转染分析法快捷、简单，易于对结果定量，因此成为启动子功能分析的首选方法。瞬时转染分析法也有两个主要局限性：首先在被转染的细胞中，质粒的人工构象和拷贝数可能会导致特异性调控元件失活或具有特异功能；其次，瞬时转染分析法不能用于检测那些需诱导或分化时间超过4872小时时间期限的研究。,稳定转染,将含有报告基因和抗药性基因的质粒转染培养细胞，培养基中加入能杀死不稳定表达抗药性基因细胞的药物，部分质粒被稳定地整合到染色体上。多数情况下，在细胞中多个质粒分子彼此相连形成多联体，多联体随机整合到多联体基因组中，因此每个被稳定转染的细胞都具有独特的整合位点。然后通过测定被稳定转染细胞中报道基因的活性，来确定目的调控区的活性。,稳定转染,稳定转染分析方法的主要优点：进行分析的调控区及报道基因通常位于近乎天然的染色质构象中，具有近乎天然的拷贝数，这些特点使调控区能更精确地模拟正常功能。在稳定转染分析中，因对转染的细胞进行了选择性扩增，所以克服子了瞬转细胞吸收DNA少的缺点。稳定转染分析的另一个特点是对随后的转录分析没有时间限制。因此，稳定转染对所需时间相对较长的研究非常有用。稳定转染分析的缺点是因为要进行药物筛选和细胞扩增，因此操作难度较大，需要的时间较长。,细胞转染途径,物理介导电穿孔法（瞬时转染、稳定转染、所有细胞）显微注射（瞬时转染、稳定转染）基因枪（瞬时转染）化学介导DEAE-葡聚糖法（瞬时转染）磷酸钙法(瞬时转染、稳定转染)脂质体转染法（瞬时转染、稳定转染、所有细胞）生物介导-病毒介导法逆转入病毒介导的转染（稳定转染特定宿主细胞）腺病毒介导的转染（瞬时转染特定宿主细胞）,电穿孔法,电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使DNA分子进入胞内，这种方法就是电穿孔。本法需要用特殊设置（电穿孔仪），把悬浮状态的受体细胞和供体DNA共同放入皿中（或杯中），再施以高压电脉冲，能够促进DNA通过细胞膜而进入胞内，并可整合到细胞DNA中，使细胞发生转化。,电穿孔法,细胞电穿孔,DNA进入细胞,电穿孔法,缺点：需要昂贵的仪器（电穿孔仪）。每种细胞电转的条件都需要进行多次优化：电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般情况下，高电场强度会杀死50%-70%的细胞。,显微注射,借助显微注射器直接把DNA注射入核内，使之发生整合入受体细胞基因组中的技术。,显微注射,优点：转染效率较高，可用于稳定转染和瞬时转染。缺点：在导入DNA时需要一个细胞一个细胞地注射，不适合大量转染细胞研究的需要。适用范围：适用于制备转基因动物。,基因枪,依靠携带了核酸的高速离子而将核酸导入细胞内。可以将大分子导入细胞。,DEAE-葡聚糖法,DEAE-葡聚糖是最早应用哺乳动物细胞转染试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取，用DEAE-葡聚糖转染成功地应用于瞬时的研究，但用于稳定转染却不是十分可靠。可以将大分子导入细胞。转染效率与DEAE-葡聚糖浓度以及细胞与DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系。,磷酸钙法,即磷酸钙共沉淀转染法，先将DNA和氯化钙混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有沉沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA免受降解。,磷酸钙法,核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。,脂质体转染法,阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。,脂质体转染法,脂质体转染法,脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞，可用于瞬时转染和稳定转染。转染效率高，比磷酸钙法高5-100倍。能够把DNA和RNA转染到各种细胞。转染的稳定性好，可重复性高。转染时最好不加血清和抗生素。阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对部分细胞可能会干扰细胞的代谢。由于脂质体对细胞有一定的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。常用细胞类型：cos-7、BHK、NIH3T3、Hela等。,病毒介导的转染,以病毒作为载体，通过病毒感染的方式将外源DNA导入到细胞中，其中以逆转录病毒及腺病毒转染系统最为常用。,病毒介导的转染,对于脂质体转染与电穿孔转染都无法成功转染的细胞系建议用病毒感染，此法可以快速100%感染，检测成功率高。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。,理想的细胞转染,转染效率高，不影响细胞正常生理活动细胞毒性重复性好安全方法简单省时、经济,报告基因,一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。,作为报告基因必须具备的条件,全序列已测定。表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物。其表达产物能进行定量测定。,常用的报告基因系统,半乳糖苷酶报告系统荧光素酶报告系统荧光蛋白报告系统绿色荧光蛋白（GFP）EBFPVectors(BlueFluorescentProtein)ECFPVectors（CyanFluorescentProtein）EYFPVectors(YellowFluorescentProtein),绿色荧光蛋白（GFP）,其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。转染后的细胞可在活细胞工作站或流式细胞仪(FACS)中直接观察或检测基因的表达。,GFP的特点,可溶性蛋白，性质稳定。荧光基因相对明亮。荧光在活细胞中即可观察，不需要固定和组织加工。GFP基因和目的基因做成融合蛋白后，可以通过转染的方法在细胞中稳定表达。,影响转染效率的主要因素,转染试剂在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。细胞状态最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。,影响转染效率的主要因素,转染方法细胞培养物:健康的细胞培养物是成功转染的基础。一定要避免细菌，支原体或真菌的污染。细胞密度:转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。血清:血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切