体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证

1、体内药物分析的样品处理和方法验证，2，1。为什么要处理生物样品？有什么生物样品吗？3.有什么样的样品处理方法？各自的特点。如何验证分析方法？5.有哪些参考标准？3.预处理生物样品的目的是1 .药物进入体内后，通过吸收、分布、代谢等排出体外。体液、组织和粪便中除了自由(圆形)药物外，还存在多种药物的代谢产物、药物和蛋白质组成的结合物、药物或其代谢产物和内源物质(如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸、硫酸连接物等)，分离后必须测定药物和代谢物。一、处理的目的，四、二。生物样品的介质构成比较复杂。血清中既包含高分子蛋白质，又包含低分子糖、脂肪、尿素等有机化合物，以及na、k、Cl-等无机化合物。这些成分会严重影响测量的准确性和灵敏度，同时污染仪器。因此，为了保护仪器，提高测量的灵敏度，确保测试结果的准确性和可靠性，必须预处理样品。在超过5，60%的能量和支出样本前处理，6，生物样本包含多种体液和组织，但实际上最常用的是相对容易获取的血液(全血、血浆、血清)、尿液、粪便、唾液。在某些特定情况下，选择牛奶，脑脊液等。第二，生物样品的种类，7，全血不易保存，血细胞含有更多的干涉物质，很少使用全血来测量药物浓度。仅适用于血浆药物浓度过低或血浆药物浓度波动严重、难以控制的药物，例如环孢素a。1全血，8，血液中药物浓度的测定通常指血浆或血清中的药物浓度，而不是包含血细胞的全血中的药物浓度。将血液放入含有抗凝剂(如肝素、EDTA)的试管中混合后，3000 4000 r/min之间的离心，血液细胞分离，上清液是血浆。2血浆，9，血浆中所含物质的种类和比例，10，血清在采血后不添加抗凝剂，在室温下静置15-30分钟，自然凝固后，用离心力分离了上清液。血浆比血浆颜色更亮，比血浆大部分纤维素也少，治疗更容易，血浆和血清的药物浓度测定值通常相同。3血清，11，一般认为，药物在体内处于稳定状态时，血浆中的药物浓度与作用点上药物的浓度密切相关。也就是说，血浆中的药物浓度反映了体内(靶器官)的状态，因此血浆浓度可以作为作用部分中药物浓度的明确指标。血浆和血清可以稳定冷冻保存，一般保存在-20 的条件下，长期保存时保存在-80 的条件下，是生物样品采集中最常用的标本。12，尿的主要成分是水、元素和无机盐。提取尿液样本后，为了保存，经常加入防腐剂。体内药物去除主要通过尿液排出，药物可以通过圆形或代谢物质及其结合体等排出。尿液中药物的浓度高，但尿液的浓度通常随尿液量的变化而变化，要测量一定时间内排出尿液的药物总量。4尿，13，唾液中包含的成分比较简单，容易得到，但只有少数药物与唾液浓度和血浆游离药物浓度有关，实际上没有太多使用，药物血浆结合率高的时候唾液的药物浓度很低，很难检测到。5唾液，14，取样后立即分析除外，为了防止药物的变化，短期保存应在4 冷藏；长期保存可在-20 冻结，不重复冻融，必要时可添加酶抑制剂和抗氧化剂。生物样品的保存：15，主要要考虑生物样品的种类，试验药物的特性及测定方法三个方面。三、常用的处理方法，1 .沉淀蛋白PPT2。液体萃取LLE3。固相萃取SPE，16，1。沉淀蛋白，在有机溶剂沉淀法中添加水溶性有机溶剂，可以改变蛋白质分子和分子之间的氢键，凝聚蛋白质。常用的有机溶剂包括以眼还眼、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。如果血浆或血清的体积比为1:3，有机溶剂可以去除90%以上的蛋白质，低温高速离心机16000r/min离心10min可以完全沉淀沉淀蛋白质。17、实际应用，大部分加50uL血浆，500uL有机溶剂，旋流离心后注入；沉淀后信号不好的话，更换有机溶剂或沉淀时添加酸或碱来调节pH值，会对结果产生很大影响。常用的酸碱：盐酸、甲酸、乙酸、氨等。18，优点：操作简单，方法开发首先考虑。缺点：仅用于样品中浓度高的药物测定。经过处理，样品中仍然有很多干扰物质，干扰结果；残留杂质阻挡热量，污染设备。19，中性盐可以代替蛋白质和水合的水，使蛋白质脱水沉淀。常用中性盐：饱和硫酸胺、硫酸钠、镁盐、磷酸盐和柠檬酸盐等。盐析方法经常与有机溶剂萃取方法一起使用，药的回收率高。添加中性盐，20，20，强酸。当pH低于蛋白质等电点时，蛋白质以阳离子的形式存在，强酸形成蛋白质阳离子和不溶性盐沉淀。常用的强酸是10%三氯乙酸等。血清和强酸的比例混合为1:0.6，可以高速离心去除蛋白质。酸性分解的药不能用这种方法去除蛋白质。21，pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子和蛋白质分子上带负电荷的羧基形成不溶性盐沉淀。常用的沉淀剂包括cus04-na2w04、zn04-NaOH等。含药血清和沉淀剂的比例为1:2，混合，高速离心，分离后接受上等液。锌盐或铜盐沉淀剂，添加22，部分酸不稳定和蛋白质结合牢剂的测定经常需要酶解。在决定尿液的药物浓度时，尿液中的药物主要以结合体形式排除，比原型药物极性大，不容易被有机溶剂提取，并且使用了很多酶解方法。酶解，23，超速离心法平衡透析法主要用于测定血浆中游离药物浓度和药物的血浆蛋白结合率。去除蛋白质的其他方法：24，药物在体内被吸收，通过transmembrane输送，因此大部分药物具有一定的脂溶性，而生物样品中的内源性杂质大部分是强极性的水溶性物质，因此根据药物分子和基质之间极性的差异，可以使用适当的有机溶剂提取药物，有机溶剂提取可以同时去除大部分杂质。2 .液-液萃取方法LLE，25，有机溶剂应选择稳定、挥发性、低毒性、不与水相混合的溶剂。常用有机溶剂包括醚、乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲醚和氯仿。应用此方法时，应考虑所选择的有机溶剂的特性、药物的特性、有机溶剂相及水相体积比、水相pH值等。酸性药物的解离：AH H2OA- H碱性药物的解离：B H2OB OH-如果药物的解离常数pKa为药物分解50%，则溶液的pH值。26、药物的提取程度主要取决于水的pH值。碱性药物的最佳pH值高于pKa1-2单位。对于酸性药物，低于pKa值1-2个单位。这样，大约90%以非电离形式存在，更容易溶解在有机溶剂中。调节PH值的常用物质包括甲酸、乙酸、盐酸或氨、氢氧化钠等。影响水性PH值-液体萃取的最重要因素27，具体萃取模式有直接萃取和反向萃取两种。优点：样品提取后去除大部分杂质，比较“清洁”；蒸发有机溶剂后再溶解，可以浓缩样品。大部分药物具有脂溶性，广泛使用。缺点：需要很长时间，工作很麻烦。另外，提取血浆时，血浆中的脂质一起提取，使用质谱时在离子源中产生矩阵效应，极大地阻碍了质谱分析结果的准确性！28、在探索方法的过程中，一般采用上述溶剂，并行操作，同时提取，额外空白对照组，比较结果，判断哪种有机溶剂的提取效果最好；否则，可以再次混合上述溶剂以调整1:1，1:2，1:3的比例。在寻求合适的提取溶剂的同时，可以添加药物的酸碱或离子对试剂，以提高回收率。在提取过程中必须严格控制pH值，对于成药，为了确保提取回收率的稳定性和再现性，必须使用缓冲溶液。29，如雌二醇的检测血浆样品100uL，同位素内部标准20uL，甲酸50uL，正己烷1毫升叔丁基甲醚3mL，旋流冲击10min，3000r/min离心10min，30，固相萃取(SPE)是80年代中期开始开发的样品预处理技术。由液-固萃取和液相色谱结合开发而成。主要通过固体填料对样品成分的选择性吸附和解吸过程，实现样品的分离、纯化和富集。主要目的是减少样品矩阵干扰，提高检测灵敏度。3 .SPE，31，固相萃取的基本原理和方法：基于液固色谱理论的SPE技术是通过选择性吸附、选择性洗脱方法富集、分离、纯化样品，包括液体和固相的物理萃取过程。也可以看作是近似简单的色谱过程。更常见的方法是通过吸附材料保存液体样品的主体，使用适当的强度溶剂去除杂质，然后用少量的好溶剂溶解，迅速分离净化和浓缩。也可以有选择地吸附干涉杂质，使被测试物质流出。32，33，提取小支柱，防止交叉污染！34、固相萃取作业一般有5个阶段：甲醇/乙腈湿柱活化，填料活化；平衡水或适当缓冲液洗涤平衡柱；将上述样品移到柱子上，取出废液。水或缓冲液最大洗涤干扰物质；溶出用少量溶剂测定的物质溶出收集。35，1。两相色谱原理2。反相色谱原理3。离子交换原理，按原理分类：36，37，SPE方法的优点：1。不会发生油画；复盖范围大。萃取效率；方便快捷，一次可提取和分离多个化合物。溶剂消耗低。自动化很容易。7.离子交换固相萃取利用离子交换原理，根据同柱极性大小的分离原理不同，可以最大限度地分离药物，消除干扰。目前商品化的固相萃取微型柱(cartridge)得到了广泛应用。比较38，3种方法：39，化学诱导的目的如下具有药物可分离特性；提高测试的灵敏度。提高药物的稳定性。提高光学异构体的分离能力。包含-coh、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能团的药物分子可以化学诱导。4 .包括化学衍生化方法，40，HPLC的化学衍生化，柱前衍生化和柱后衍生化两种方法。柱前衍生化分析前，如果可能，提取分离药物，然后衍生，以防止包含相同功能组的其他杂质也影响分离。柱后衍生化在柱分离后进行药物处理，从而形成对探测器敏感度高的衍生物。HPLC方法中常用的衍生物试剂有邻苯二甲醛、单磺酰氯、荧光胺等。，41，最小定量极限为10pg级！42、建立试验中药物的物理、化学性质及体内存在分析和测定目的及必需生物样品的类型和预处理方法实验室条件，建立体内药物分析方法，43，1。光谱分析2。色谱3 .毛细管电泳4 .免疫分析5。同位素方法、体内药物分析方法一般分为以下类别：44、体内药物的HPLC-MS/MS分析方法开发一般过程：1。回顾相关文献，了解药物的理化特性，选择内部标准物质；使用标准产品扫描质量分析条件。选择柱和移动相，探讨合适的液体条件。4.根据样品矩阵准备模拟生物样品，选择适当的样品处理方法处理后进样品分析；5.可以调整试样处理方法或液体条件，进一步优化质量分析参数。6.根据考试目的确定定量范围，并考察方法。45、方法验证、生物样品测量的核心是方法验证。方法鉴定是整个药物动力学研究的基础。这是药动学研究与其他药理学毒理学研究的不同之处。所有的药动学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只能得出可靠的结果，因此必须对已确立的方法进行验证。另外，在实际样品测试过程中，也要进行方法质量控制，准备伴随标准曲线，测量质量控制样品，确保测试方法的可靠性。46，47，guidelinesonbioanalyticalmethvalidation-EMEA，48，49，50，4。校准曲线Calibrationcurve，结果要求：校准曲线必须至少包含6个强度点以及MatrixBlank和ControlZero点(仅限参考，而非校准曲线计算)，如果需要，可以进行双重测量。个别浓度点的精确度必须在85%至115%之间，精确度必须低于15%，数量下限必须在80%至120%和20%之间。对于不符合要求的浓度点，可以排除计算，但至少75%的浓度点符合要求。方法验证过程中，统计至少应包括3条合格标准曲线。51，52，质量控制样品QualityControl，QC，将标准产品添加到生物矩阵中，对制造的模拟生物样品进行方法验证，起到检验样品和样品测量的方法质量控制作用。低浓度质量控制(LowQC)浓度不超过LLOQ的3倍。中等浓度质量控制(MediumQC)浓度通常是定量范围的中等浓度。高浓度质量控制(HighQC)浓度为最低ULOQ的75%。质量控制样品建议独立人员一次性制造，通过升级分析后分档保管，冷冻保管，每次取用足够数量的样品，其余作废。53，54，55，8。稳定性稳定性Stability、8.1分析和内部标准存储和标准工作流的稳定性8.2示例冻结/融化的3个解决方案稳定性；Freeze