液相色谱-质谱(LC-MS)联用的原理及应用

。液相色谱-质谱的原理及应用简介。在线色谱-质谱结合色谱分离能力和质谱的定性功能，实现复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且简化了样品的预处理过程，使样品分析更加简单。气相色谱-质谱包括气相色谱-质谱和液相色谱-质谱。液相色谱-质谱联用仪和气相色谱-质谱联用仪相互补充，分析不同性质的化合物。液相色谱-质谱和气相色谱-质谱的区别是：气相色谱-质谱是最早商业化的仪器，适用于分析小分子、挥发性、热稳定性和气化性化合物。通过电子轰击获得的光谱可以与标准光谱库进行比较。液相色谱-质谱联用技术主要解决以下问题：非挥发性化合物的分析和测定；极性化合物的分析和测定；热不稳定化合物的分析和测定：高分子量化合物(包括蛋白质、多肽、聚合物等)的分析和测定。)；没有商业化的光谱库可以比较和查询，只能建立光谱库或者自己分析光谱图。现代有机和生物质谱的发展在20世纪80年代和90年代经历了两次飞跃。在此之前，质谱通常只能测定分子量低于500道尔顿的小分子化合物。20世纪70年代，场解吸电离技术发展起来，可以测量分子量高达1500 2000道尔顿的非挥发性化合物，但重复性差。快速原子质谱(FAB-MS)发明于20世纪80年代初，用于分析分子量数千的多肽。随着生命科学的发展，待分析的样品越来越复杂，分子量范围越来越大。因此，出现了电喷雾电离质谱和基质辅助激光解吸电离质谱。除气相色谱-质谱的电子电离和电离源外，目前的有机质谱和生物质谱采用大气压电离(包括大气压电喷雾电离电喷雾电离、大气压化学电离APCI、大气压光电离APPI)和基质辅助激光解吸电离。前者通常使用四极杆或离子阱质量分析器，统称为飞行时间质谱仪。后者通常使用飞行时间质谱仪，形成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。原料药-质谱可与液相色谱和毛细管电泳等分离方法结合，从而扩大其应用范围，包括药物代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、组合化学、有机化学等。质谱具有耐盐、耐添加剂、采样速度快、操作简单等特点。质谱原理简介质谱是一种分析方法，首先将物质电离，根据离子的质荷比将其分离，然后测量各种离子光谱峰的强度，达到分析目的。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，以离子的质荷比为横坐标的柱状图是我们常用的质谱图。常用术语：质荷比：离子的质量(以相对原子量单位表示)与其携带的电荷(以电子电荷单位表示)之比通常被称为离子峰或简称为m/Z峰质谱中的峰：离子丰度：检测器检测到的离子信号强度。基峰：在质谱中，在指定的质荷比范围内强度最大的离子峰称为基峰。总离子流图。质量色谱图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子，总离子流图：在选定质量范围内所有离子强度随时间或扫描时间的总和图，也称为TIC图，质量色谱图，特定质量(或质荷比)离子强度随时间变化的曲线图。在复杂混合物分析和痕量分析中，质谱测定特征离子是液相色谱/质谱测定中最有用的方法。当样品浓度很低时，TIC上通常没有峰质量色谱图、总离子流图和准分子离子：是指与分子有简单关系的离子，通过它们可以确定分子量。液体质量中最常见的受激准分子离子峰是M H或M-H-在电喷雾电离中，质量大于分子量的离子，如M 1、M 23、M 39、M 18.被称为准分子离子，表示为：米赫，米纳等，碎片离子，由准分子离子的一个或多个分裂阶段产生的产物离子。片段峰的数量和丰度与分子结构有关。大量表示分子容易断裂，高丰度片段峰表示离子稳定，也表示分子容易断裂生成离子。麻黄碱，分子量=165，多电荷离子是指具有2个或更多电荷的离子，通常存在于蛋白质或多肽血浆中。在有机质谱中，单电荷离子占绝大多数，只有那些不容易分裂的基团或分子结构，如共轭体系结构，才会形成多电荷离子。它的存在表明样品相对稳定。利用电喷雾电离技术，可以产生多种电荷的离子，最终由计算机自动转换成元素/电荷比离子。同位素离子是由元素的重同位素组成的离子，称为同位素离子。各种元素的同位素基本上是根据它们在自然界中的丰度比出现在质谱中的，这对于用质谱测定化合物和碎片的元素组成非常方便。稳定同位素也可用于合成标记化合物，如：氘和其他标记化合物，然后质谱可用于检测这些化合物，而不会改变质谱的外观。只有质量数的位移，从而解释化合物的结构、反应过程等。如何看待质谱：(1)确定分子离子，即确定分子量氮的规律：含偶数氮原子的分子的质量数是偶数，含奇数氮原子的分子的质量数是奇数。高质量碎片离子有合理的质量差异。38和1013、2125之间的任何质量差都是不可能的，这意味着碎片或杂质。(2)元素组成的测定，即分子式或片段化学式的测定。高分辨率质谱可以直接从分子量计算出化合物的元素组成，从而推导出分子式。低分辨率质谱使用元素的同位素丰度，例如：(3)峰强度与结构的关系。丰度反映了离子结构在元素周期表中从上到下是稳定的。从右到左，杂原子外层的非键电子更容易电离，含有正电荷的能力越强，支链就越容易断裂，这与有机化学基本一致，总是在分子的最弱部分断裂。不同类型的有机物有不同的裂解方式。相同类型的有机物有相同的裂解方式，但质量数的差异需要凭经验记忆。质谱分析的一般步骤(适用于低分辨率的小分子光谱图，如果元素成分已经从高分辨率的质谱图中获得，则更好)(1)检查获得的光谱图，扣除背景和其他因素造成的失真，并考虑操作条件是否合适(2)综合样品的其他知识：物理和化学性质，如熔点、沸点、溶解度、样品来源、光谱、光谱数据等。)，(3)尽可能判断分子离子。(4)可能的结构属性的假设和排列：中性碎片，如M-1、M-15、M-18、M-20、M-31，它们在裂解中损失，如高质量离子所示，平均损失H、CH3、H2O、HF、OCH3.(5)假设一种分子结构，与已知的参考光谱进行比较，或取类似的化合物，并与其质谱进行比较。有机质谱的特点和优势：(1)分子量准确，无法与其他技术相比。(2)高灵敏度，常规10-7-10-8g，单离子检测高达10-12g。(3)速度快，几分钟甚至几秒钟。(4)便于混合物分析。液相色谱/质谱和质谱/质谱对难以分离的混合物特别有效，而其他技术则不能胜任。(5)多功能，广泛适用于各种化合物。限制：(1)异构体，poo质谱仪由以下部分组成：数据和电源系统 真空系统 采样系统 离子源质量分析器检测接收器 真空系统 真空系统、离子源、质量分析器和质谱仪的检测器必须在高真空状态下工作利用这一特性，我们可以通过液相色谱-质谱软电离获得化合物的准分子离子，从而获得分子量。真空装置由机械真空泵(前极低真空泵)、扩散泵或分子泵(高真空泵)组成，用于从离子源和分析仪中抽取真空。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，而在足够低的真空下，灵敏度很低。样品引入系统，将分析样品引入离子源的装置，包括直接样品引入、气相色谱、液相色谱和接口、加热样品引入、参考样品引入等。离子源是一种将被分析样品的原子或分子电离成带电粒子(离子)并加速离子进入分析器的装置。根据不同的电离模式，有机质谱中常用的有以下几种，其中电子电离和电喷雾电离是最常用的。电子轰击电离-硬电离。化学电离化：化学电离化的核心是质子转移。FD(现场解吸):现场解吸-目前基本上被工厂取代。Fab :快速原子轰击-或铯离子(LSIMS，液体二次离子质谱)。电喷雾电离是最软的电离方法。适用于极性分子分析，可以分析小分子和大分子(如蛋白质分子多肽等)。)APCI(大气压化学电离):大气压化学电离同上，更适合弱极性小分子。APPI(大气压摄影):大气压光喷雾电离-同上，更适合非极性分子。基质辅助激光解吸电离。它通常用于飞行时间质谱和飞行时间质谱，尤其适用于蛋白质和多肽等大分子。米纳或M-H-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子。因为质量/电荷比是由质谱仪确定的，所以质量范围只有几千质量的质谱仪可以测量成千上万的生物大分子。电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰，因此可以直接测定混合物和热不稳定的极性化合物。其易形成多电荷离子的特点可用于分析蛋白质和DNA等生物大分子。化合物的结构通过调节离子源电压来控制离子的分裂(离子源中的CID)来确定。大气压化学电离的特征(APCI)。大气压化学电离也是一种软电离技术，它只产生一个电荷峰，适用于质量数小于2000道尔顿的弱极性小分子化合物的测定。适用于高流动梯度洗脱/高和低水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压来控制离子的分裂。电喷雾与大气压化学电离的比较，电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离通过质子转移在高压放电中产生M H或M-H-离子。样品流速：APCI源可为0.2-2ml/min；然而，电喷雾源的允许流速相对较小，通常为0.2-1毫升/分钟。断裂程度；APCI源的探针处于高温，足以分解热不稳定的化合物。灵敏度：一般认为电喷雾有利于分析大极性小分子、生物大分子和其他大分子量化合物，而APCI更适合分析小极性化合物。多电荷：APCI源不能产生一系列多电荷离子，纳米喷雾离子源，特别设计的纳米喷雾离子源特别适用于微型生化样品，其流速范围可从5N升/分钟到LUL/分钟。一滴样品可以分析几个小时。最大灵敏度可以用最少的样品消耗获得。灵敏度可以高达fmole。并且可以直接与正负离子模式：在一般商用仪器中，ESI和APCI接口有正负离子测量模式可供选择。根据样品的性质，可以同时选择两种模式。质量分析器：是质谱仪中根据质荷比分离离子的部分。离子通过分析器后，根据不同的质荷比(M/Z)进行分离，相同的M/Z离子聚焦在一起形成质谱。质量分析器的分类：双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(扇形)、四极质谱仪(四极)、飞行时间质谱仪(飞行时间质谱仪)、离子阱质谱仪傅立叶变换-离子回旋共振质谱仪(傅立叶变换-离子回旋共振质谱仪)、四极质谱仪串联多级质谱仪、三重四极质谱仪(三重四极质谱仪)(质谱)-飞行时间质谱仪，原则上，执行质谱/质谱的仪器可分为两种类型。第一类仪器按空间顺序使用质谱，由两个质谱仪串联组装，即前面列出的串联多级质谱仪。第二种类型按时间顺序使用质谱仪的离子存储容量，由带有存储离子的分析器组成，如离子回旋共振(ICR)和离子阱质谱仪。然而，不能执行母离子扫描或中性损失。实验室现有的质量分析仪类型有：串联四极杆质谱仪(MS/MS):三重四极杆离子源第一分析仪碰撞室第二分析仪接收器ms1ms2q1q2q3。qqq仪器可以很容易地改变离子的动能，所以它扫描速度快，体积小。它经常被用作进入传统实验室的桌面。其缺点是质量范围和分辨率有限，不能进行高分辨率测量，只能达到单位质量分辨率。(该化合物的分子式可通过高分辨率获得)，液体质量连接中使用的碎裂手段，能量以碰撞的形式传递给分子离子，并且该能量足以破坏能量亚稳态分子中的某些化学键，并引起某些特定分子的结构重排。碰撞诱导解离CID质谱：选择一定质量的离子作为母离子，进入充满目标反应气体的碰撞室(碰撞气体：氦、氩、氙、甲烷等。)发生离子-分子碰撞反应生成“子离子”，通过MS2的分析仪和接收器获得子离子质谱。通常称为CID(碰撞诱导解离)光谱，影响CID质谱的因素：主要影响因素包括：所用碰撞气体的类型、压力、离子能量、仪器配置和离子电荷状态。由于不可能在完全相同的条件下用不同的仪器分析样品，任何给定的化合物在不同的条件下都会给出不同的质谱，特别是各种离子峰的相对丰度差异几乎是不可避免的。因此，建立一个商业光谱库进行检索仍然很困难，只能手工分析或者自己建立。大气压电离技术产生的离子是偶电子离子，它们的主要碎片应该是由化学键的诱导分裂和重排反应产生的。因此，电子电离质谱中所总结的偶电子离子的裂解规律可以普遍应用于化学电离质谱的解释。接收离子束电流的装置包括电子倍增器、光电倍增管、微通道板、数据和电源系统，该系统对接收到的电