肿瘤标志物检测方法PPT课件

肿瘤标志物的检测方法概括地说，相同的标志物可以用不同的方法检测，例如血清水平、免疫组化水平可以检测CEA和P-gp等，细胞和分子水平可以用FCM和RT-PCR检测。 二血清学水平，血清学水平：除传统放射免疫分析(RIA )和酶联免疫分析(ELISA )外。 目前国内主要应用于临床的三种全自动免疫化学分析系统(化学免疫发光免疫分析系统、荧光免疫分析系统和电化学发光免疫分析系统)，血清肿瘤标志物的检测有快速、准确、半定量的。 可以检测AFP、CEA、CA19-9、CA72-4、CA125、CA15-3、NSE、Cyfra21-1、PSA、f-PSA等。 1放射免疫分析(一)、放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA )放射免疫分析自1960年代诞生以来，已广泛应用于生物医学各领域。 20世纪90年代，RIA技术研究的主要进展是试管固相法。 学者将试管固相法称为第四代RIA。 固相RIA与免疫放射测定法(IRMA )的灵敏度、特异性、稳定性及测定范围优于液相竞争法，无需特别用离心机分离，操作程序简化，检测精度提高的活化试管RIA与IRMA技术系统的共价键均匀、稳定性好，实现了分析技术的进一步，易于实现自动分析。 1放射免疫分析(二)、2酶免疫分析(一)、酶免疫分析(enzymeimmunoassay，EIA)RIA和IRMA有独特、难以克服的缺陷，由Engvall和Vanweemen分别指导的研究小组将同位素替换为酶，1971年进行酶免疫分析技术(EIA ) 由于其标志物制备简单、有效期长、环境无污染等特点，EIA技术得到了迅速推广和发展。 20世纪90年代后期，EIA引进了扩增系统，主要应用生物素亲和度系统，测定的灵敏度赶上或超过了RIA。 酶联免疫荧光测定法(ELIFA )兼具酶联免疫吸附试验(ELISA )和荧光免疫分析(FIA )两种方法的优点，其灵敏度明显高于传统ELISA，最小检测值达10-15mol/L。 增强发光酶联免疫分析法(ELEIA )是1980年代后期发展起来的一种新的免疫分析技术，其特征是酶能增强发光信号，且发光信号稳定，该方法的最小检测值达到10-20mol/L。 2酶联免疫分析(二)、3化学发光免疫分析(一)、化学发光免疫分析(chemiluminesentimmunoassay，CLIA)1981年，Pannagli结合化学发光原理和免疫反应建立了化学发光免疫分析(CLIA )。 该方法灵敏度可达到释放水平，但影响检测结果的因素较多，稳定性差，发生化学反应后无法再现样品的发光。 用甲基吖啶酮酯标记抗体更为理想，无需添加催化剂，外因干扰少，操作简单，稳定性高，标记蛋白后不影响发光信号的产生。 全自动测量仪器在这一领域的开发发展迅速，大大提高了该方法的分析效率和推广应用。 近年来免疫电化学发光(IECL )技术发展迅速。 该方法具有灵敏、快速、稳定、选择性强、重现性好、操作方便、方法多样的优点。 集电化学发光、生物素抗生素、免疫分析于一体，集固相免疫分析发展的磁微球等技术于一体，是许多学科交叉的研究领域。 IECL分析方法多种多样，广泛应用于抗原、半抗原和抗体免疫检测，其线性范围广泛，符合临床检测的需要。 IECL技术的发展趋势是合成新的发光标记物，优化标记技术和免疫分析方法。 3化学发光免疫分析(二)、4小时荧光免疫分析(一)、时间荧光免疫分析(timsollesolvedfluorenceimmunoassay，TRFIA )是1980年代初出现的另一种非放射性免疫分析方法，其主要特征是示踪剂为标记稀土元素，如Eu3、Tb3或Sm3TRFIA灵敏度高，应用范围广，目前已完全自动化了分析技术。 将Eu3标记重组g蛋白用作通用示踪剂，有利于大幅度提高标记化合物的质量，降低非特异性结合。 提高半抗原标记率将方法灵敏度提高到新水平，以适应生物样品中低浓度物质的测定。 半抗原和聚赖氨酸结合的标记eu-3的前体链亲和素和甲状腺素球蛋白结合的eu-3的前体。 利用这两种人工合成的标记前体制备的Eu3标记物，使方法的灵敏度提高了12位数。 4小时荧光免疫分析(二)、5电镜水平、电镜水平：电镜酶细胞化学水平技术、免疫电镜技术、原位杂交电镜技术。 三组织化学水平、组织化学：免疫组化和原位分子杂交组化技术是今年发展的边缘学科。 将免疫学技术和分子生物学技术与组织病理学切片法巧妙结合，显示组织细胞原位化学成分和特定基因片段。 常规标本中，约5%-15%的疑难病和恶性肿瘤应用免疫组化进行鉴别诊断和预后分析。 PorterD利用mRNA原位杂交检测细胞水平的基因表达，在组织芯片上免疫组织化学检测乳房导管的原位癌和浸润癌病理学特征及临床意义。 影像分析技术可定量检测组织切片上肿瘤细胞DNA的含量和形态学分析，对判断肿瘤恶性程度和预后具有重要的临床价值。 三组织化学水平，四细胞水平，细胞水平：流式细胞术(FlowCytometry，FCM )。 利用FCM定量测定细胞、细胞器官结构和一些功能的细胞表面特征标志分析和筛选特定细胞亚群的先进技术方法。 利用FCM检测白血病和淋巴瘤标志物(CD系列)有利于诊断和鉴别诊断的FCM测定恶性肿瘤细胞的pgp，可为临床选择化疗药物提供依据，采用FCM测定消化道肿瘤外周血CD44水平。 六分子水平、分子学水平：聚合酶链反应(PCR )是一种极其简单、敏感、高效、特异、快速体外扩增DNA的技术。 国内外采用RT-PCR法检测外周血中肿瘤细胞的主要标记基因是细胞角蛋白19(CK19mRNA )和20(CK20mRNA )用于上皮性恶性肿瘤的癌胚抗原(CEAmRNA )，是用于直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌等CEA分泌性肿瘤的甲氧西林(affa ) 七生物芯片级、基因芯片： ZhuG报道结合显微分割和芯片技术分析乳腺癌不同部位肿瘤细胞间基因表达差异的组织芯片：组织芯片有助于节约试剂、人才和费用。 过去分析过一个肿瘤的试剂量现在可以分析数百至数千人的肿瘤，而且可以同时在同一切片上进行蛋白质芯片：为多标记联合检测提供理想的工具，包括英国RANDOX公司在世界上同时销售的8种肿瘤标志物在内的蛋白质芯片。 八表面增强激光分析电离飞行时间质谱技术(一)、表面增强激光分析电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS ) :是近年来新兴的差异蛋白质组学技术，具有快速、准确、高吞吐量、灵敏度等特点，为蛋白质组学提供了有效的技术，加快了肿瘤标记的筛选与研究。 SELDI-TOF-MS由蛋白质芯片、飞行质谱软件部分构成。生物样品(血清、细胞等)、吸附在芯片上、特异性结合的蛋白质、能量吸收分子、结合的蛋白质分析为带电离子(，- )、肿瘤标记、软分析、质谱、特定蛋白