荧光共振能量转移 FERTppt课件

.,陈同生华南师范大学信息光电子科技学院,荧光共振能量转移FluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET),.,分子能级与荧光,2.荧光（Fluorescence)：当处于基态的分子吸收光能后进入激发态，并且立即返回基态并以光的形式释放能量，这种光称为荧光。,4.激发(Excitation,Ex)和发射(Emission,Em)光谱（Spectra):,1.能级（EnergyLevel）：原子的可能状态是不连续的，因此各状态对应能量也是不连续的。包含电子能级、振动能级和转动。,3.磷光（Phosphorescence）:分子从激发三线态返回基态以光的形式释放能量。,.,CFP,Ex.440nm,Ex.470nm,Em.470nm,YFP,Em.535nm,荧光共振能量转移(FRET)现象,3.FRET现象的特征:选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光,.,FRET原理(Principle),.,FRET的条件,发生FRET需要三个条件：,1、供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱必须有显著的重迭，一般大于30；,2、供体分子和受体分子间的距离必须在110nm之间.D和A间的FRET效率：,3、供体分子的发射态偶极矩与受体分子的吸收态偶极矩、以及它们的向量必须满足一定的条件,R0:E=50%时供体和受体分子间的距离.对于特定的供体受体对是常数;,R:供体和受体分子间的距离.,E:FRET效率.对于R特别灵敏.,举例:假设R0=5nm,1）R=10nm,E=1.5%,2）R=5nm,E=50%,3）R=6nm,E=25%,.,1)蛋白分子的共定位;2)蛋白分子聚合体;3)转录机制;4)转换途径;5)分子运动;6)蛋白折叠等生物学问题.,FRET的应用,通过FRET技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息。常用于解决如下问题:,.,FRET技术应用一:检测两个发光分子间的重合与共定位,.,荧光标记利用FRET技术检测不发光分子间相互作用的策略,.,FRET技术应用二:检测分子间的相互作用,.,FRET技术应用三:检测分子的折叠与构象变化,.,FRET技术应用举例：细胞内钙离子浓度的实时测量,MiyawakiA,etal.,Nature1997,388:882-887,(b),.,BFP-GFPBFP-YFPCFP-YFPCFP-dsREDGFP-dsRED,在FRET实验中经常使用的供体-受体荧光分子对,2.绿色荧光蛋白类(GreenFluorescentProteins,GFPs),1.染料类(Dye),FITC-RhodamineAlexa488-Cy3Cy3-Cy5,.,参考阅读文献,JonathanD.Violin,etal.,AgeneticallyencodedfluorescentreporterrevealsoscillatoryphosphorylationbyproteinkinaseC.JCellBiology,2003,161:899909ElizabethAJetl.,FRETImaging.NatureBiotechnology,2003,21:13887-1395RajeshBS.Fluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)microscopyimagingoflivecellproteinlocalizations.JCellBiology,2003,160:629633JinZhang,etal.,.GeneticallyencodedreportersofproteinkinaseAactivityrevealimpactofsubstratetethering.PNAS,2001,98:1499715002MichaelG.Erickson,etal.,DsRedasaPotentialFRETPartnerwithCFPandGFP.BiophysicalJournal,2003,85:599611AlexanderSorkin,etal.,InteractionofEGFreceptorandGrb2inlivingcellsvisualizedbyfluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)microscopy.CurrentBiology2000,10:13951398,.,思考题,2.你认为FRET技术特别适合什么领域?举例说明。,1.