简明微生物工程 3-2发酵机制-酒精、柠檬酸.ppt

三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白的原理,TCA与蛋白质之间主要有以下几个方面的作用：在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐；作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团,使之聚集沉淀；随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显；电泳图谱显示，人血清蛋白、牛血清蛋白单体谱带有较明显的展宽现象，这可能是由于TCA的结合，使SDS与蛋白质的结合量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成迁移率的不一致。,微生物的发酵机制,本章重点：1、酒精、乳酸、甘油的发酵机制2、柠檬酸的发酵机制3、谷氨酸的发酵机制,EMP途径,HMP途径,ED途径,TCA循环,第一节糖代谢产物的发酵机制,一、糖酵解途径及调节,葡萄糖抑制激活己糖激酶ADPAMP葡萄糖-磷酸果糖-磷酸磷酸果糖激酶ATPADPAMP果糖-，二磷酸3-磷酸甘油醛二羟丙酮磷酸3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸葡萄糖-磷酸磷酸烯醇式丙酮酸果糖-,二磷酸丙酮酸激酶ATP3-磷酸甘油醛丙酮酸,葡萄糖分解途径,胞质线粒体TCA循环葡萄糖丙酮酸乙酰CoACO2+H2O乙醇乳酸,丙酮酸的去路,O2线粒体乙酰CoATCACO2+H2ONADHNAD+丙酮酸乳酸丙酮酸脱羧酶NADHNAD+乙醛乙醇羧化酶乙酰CoA,丙酮酸,乙醛,乙醇,CO2,H,H,乳酸,草酰乙酸,H,ATP,琥珀酸,丙酸,CO2,CO2,甲酸,(6),(5),(4),(3),(2),(1),H2,CO2,乙酰CoA,ATP,乙酸,乙醇,H,乙酰乳酸,CO2,3-羟基丁酮,H,2,3-丁二醇,CO2,H2,乙酰CoA,ATP,乙酸,乙酰乙酰CoA,CO2,ATP,ATP,H,H,丙酮,2-丙醇,丁酸,丁醇,H,二.乙醇生成机制,脱羧酶NADHNAD+葡萄糖丙酮酸乙醛乙醇1mol葡萄糖按100%生成2mol乙醇，重量理论转化率：2*46.05/180.1*100%=51.1%实际只有95%生成乙醇，5%构成细胞或副产物，因此乙醇对糖的转化率约为48.5%副产物：杂醇油、琥珀酸、酯类、糠醛、甲醇等,三、甘油的合成机制,1、正常情况，无氧生成乙醇2、加入抑制剂（NaHSO3),形成甘油二型发酵3、抑制剂不可太多，否则中毒，因此仍有乙醇4、碱性（pH7.6）条件下，乙醛歧化，产生甘油、乙醇、乙酸、CO2酵母的三型发酵,四、乳酸发酵机制,1、同型乳酸发酵：产物只有乳酸NADHNAD+葡萄糖=丙酮酸=乳酸1mol葡萄糖按100%生成2mol乳酸，乳酸对糖的理论转化率：2*90/180*100%=100%进行同型乳酸发酵的M：保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌,2、异型乳酸发酵通过HMP途径的发酵,*概念葡萄糖发酵除产生乳酸外还有CO2、乙醇或乙酸。,i)异型乳酸发酵经典途径转化率50,肠膜明串珠菌属利用葡萄糖的反应,短乳杆菌利用核糖的反应,ii)双歧杆菌途径50,净5个,同型、异型乳酸发酵比较,100,50,五、柠檬酸的发酵机制,为什么黑曲霉能够过量积累柠檬酸？2丙酮酸脱氢酶3柠檬酸合成酶4乌头酸水合酶5异柠檬酸脱氢酶6酮戊二酸脱氢酶,（一）、柠檬酸积累的机制：,1由于锰离子缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH4浓度升高和形成一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别解除了对PFK的代谢调节，促进了EMP途径的畅通。2、由于丙酮酸羧化酶组成型，不被调节控制，就源源不断地提供草酰乙酸。原料充足,黑曲酶的标准呼吸链和侧系呼吸链,NADH2琥珀酸,黄素蛋白,Y,X,O2,侧系呼吸链,细胞色素b,细胞色素c,细胞色素a、a3,水杨酰异羟肟酸,抑菌素抑制,EMP途径的磷酸果糖激酶是一种调节酶。在正常生理浓度范围的柠檬酸和ATP对酶有抑制作用，AMP、无机磷和NH4对酶有活化作用，NH4还能有效解除柠檬酸和ATP对此酶的抑制。,一、柠檬酸积累的机制：,3、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。来路畅通4、由于顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸90：3：7同时在控制Fe2+含量时，顺乌头酸水合酶活力低，使柠檬酸积累，一旦柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠檬酸脱氢酶活力、从而进一步促进了柠檬酸自身积累。去路阻断5、柠檬酸的积累使pH值下降，在低pH值下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。,二、DCA