HIV核酸检测技术2014.ppt

HIV核酸检测及婴幼儿诊断,HIV核酸检测的意义,早期诊断婴儿的早期诊断：HIV感染母亲所生小于18个月龄的婴儿，不同时间的两次HIV核酸检测均为阳性即可作出诊断。18个月龄以上儿童诊断与成人相同：有急性HIV感染综合症或流行病学史，且不同时间的两次HIV核酸检测结果均为阳性，即可诊断。也可使用多样品集合的方法，对采供血机构的原料血浆以及HIV抗体阴性的高危人群样品进行集合核酸检测，及时发现窗口期感染，降低“残余危险度”，减少二代传播。,疑难样本的辅助诊断在一般情况下，HIV抗体检测足以对HIV感染与否做出正确诊断，但在特殊情况下，单纯HIV抗体检测结果不能进行明确的诊断，如在感染早期或疾病终末期出现抗体不确定反应时，RNA的测定结果可帮助提供HIV感染早期或终末期的证据。由于试剂的灵敏度、接受有效的抗病毒治疗后以及存在长期低水平病毒的少数感染者等原因，应对其它检测数据和样品背景情况进行综合判断。,遗传变异监测可用于HIV分子流行病学监测，包括HIV-1和HIV-2感染的鉴别诊断、HIV感染传播链的分析、HIV基因亚型和重组病毒的鉴定和分析以及人群HIV遗传变异趋势的监测,耐药性监测可用于HIV耐药检测和监测，指导公共卫生医生了解耐药性病毒株流行的态势和指导临床医生判断抗病毒治疗效果和修改抗病毒治疗方案。,病程监控及预测HIV感染发生后病毒载量变化具有一定规律，这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。因此定期进行病毒载量检测有助于确定疾病发展的阶段，以确定相应的治疗方案,指导抗病毒治疗及疗效判定通常在病毒载量达到一定水平后（如35，00050，000c/ml）抗病毒治疗才显示良好的治疗效果。治疗后，通过病毒水平的检测能够确定治疗是否有效。通常在治疗6个月后病毒水平降低0.5log以上才被认为临床有效。,样本采集原则,样品恰当的采集、保存和运送是所有检测需要考虑的很重要的一部分。样品的采集和保存时，要使用无菌技术，包括消毒管、吸头和试剂及工作环境都要防止样品污染。,样品的采集,艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。病毒载量通常不使用全血。血清的检测结果大约是血浆的50（3080），可能是因为HIV病毒颗粒被包裹在纤维蛋白网络中,血浆中RNA量比血清中高并稳定。全血中病毒载量非常不稳定。EDTA抗凝的RNA比肝素、ACD好，并且肝素对PCR扩增有抑制作用。（用ACD抗凝的样品检测结果大约会比EDTA抗凝的样本低15)采集的样品应在48小时以内分离血浆。,样品的保存,用于核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于20以下，进行病毒RNA检测的样品如长期（3个月以上）保存应置于80或液氮里。,样品的运送,病毒载量测定的样品应为血浆，样品应置于带螺旋盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。随样品应附有送检单，送检单应与标本分开，不能混放。在冷冻条件下运送，每一包装的体积不得超过50ml。,实验室设置原则,明确实验室的设置原则和工作流程设计，最终目的是为避免实验室污染。明确实验室设置和工作流程中好的和不好的实例。明确我们当前实验室设置中，为避免实验室污染有必要进行的整改。,要点：,各区必须是相互独立的，有条件各区内分别设置缓冲间，以保证不同区之间始终完全分开。各区的仪器设备以及各种物品必须专用。试剂准备区和样品处理区科保持低度正压或常压，是空气始终由室内流向室外，以避免扩增物进入此区。扩增产物分析区保持低度负压，可安装排风扇或其他排风装置。也可以设在远离其他各区的地方。工作时必须遵循单一工作流向进行，工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区。清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。,三实验室布局实例(备选1),实验室2,实验室3“扩增后Lab电泳分析、测序反应,和毛细管电泳,实验室1“样品处理Lab样品接受储存MastermixpreparationRNA提取和第一轮PCR反应混合,“扩增Lab第一轮扩增2ndroundPCRset-up第二轮扩增在密闭箱中以专用加样器操作,样品FrozenplasmaWholebloodDBS,13,PCR工作站(Dead-airCabinets),15,三实验室布局(备选2A),实验室2“样品处理和PCRLab样品接收储存提取和第一轮PCR反应混合,样品FrozenplasmaWholebloodDBS,1stroundamplification2ndroundPCRset-up实验室1,“无模板Lab试剂储存主反应混合物制备,实验室3“扩增后Lab第二轮扩增、电泳分析、测序反应和毛细管电泳,在密闭箱中以专用加样器操作,16,三实验室布局(备选2B),实验室3“扩增后Lab1stroundamplification2ndroundPCRset-up,第二轮扩增、电泳分析、测序反应和毛细管电泳如果不需进行nestedPCR，备选2B更理想,样品FrozenplasmaWholebloodDBS实验室1“无模板Lab试剂储存主反应混合物制备,实验室2“样品处理和PCRLab样品接收储存提取和第一轮PCR反应混合,在密闭箱中以专用加样器操作,试剂配制,只能在规定区域完成，配制完后，试剂必须及时放回存放区。,核酸提取,在规定区域完成保证无菌、实验材料无菌并一次性使用保证无核酸酶污染,加样和扩增,只能在规定区域完成，加完后盖紧盖子并作好标记。操作超过10分钟时应将反应管置于冰盒内。扩增仪预热不少于20分钟,扩增产物分析,酶切、电泳、杂交等，在产物分析区完成定量检测通常采用商用系统。,结果判定和报告,定性检测：HIV核酸检测阴性，只能报告本次实验结果阴性，不排除感染可能。HIV核酸检测阳性，可作为感染的辅助诊断指标，不单独用于感染的诊断。报告结果是应注明反应条件和引物序列。,定量检测按照读数报告结果，应注明使用的方法、样品种类和样品量。测定结果低于最低检测限时，应注明最低检测限水平。低于最低检测的结果不能排除HIV感染。应附上仪器打印的数据。,2020/5/26,28,常用的病毒载量测定方法,分枝DNA信号放大系统HIV-1Quantiplex(bDNA)逆转录PCR系统AmplicorHIV-1Monitor（RT-PCR）核酸序列扩增系统NucliSensHIV-1QT（NASBA）,2020/5/26,29,各种HIV定量检测方法的比较,2020/5/26,30,关于不同HIV定量检测方法的选择,目前用于统一不同定量方法检测值的标准品还没有问世不同定量方法结果之间还无法直接比较同一病人治疗前后建议用同一方法进行HIV定量检测,2020/5/26,31,提高敏感性的方法增加标本用量，例如从500l血浆增加到1ml离心沉淀病毒颗粒，离心时间从60min延长到80minat23,600 xg减少内部定量标准的体积，例如从25l减少到6.6lperlysisvial减少沉淀的病毒重悬的体积，例如从100l减少到55l加底物孵育时间延长1015min,2020/5/26,32,假阳性(FalsePositive)控制污染物理隔离PCR前后的反应器械专用（加样器、吸头、离心机、离心管、手套、工作服、笔）分装试剂阳性和阴性对照最近的进展防气溶胶吸头半自动操作封闭试管系统（实时PCR）全自动（样品处理扩增检测）,2020/5/26,33,假阴性(FalseNegative)原因序列变异丢失核酸样本核酸样品被消化抑制DNA聚合酶的活性预防避免肝素、血红蛋白、乙醇、酚、SDS使用合适的提取技术检测阳性对照内部对照,选择病毒载量检测的注意事项,方法的线性范围、特异性、重复性、对不同亚型的检测性能检测试剂和耗材等消耗品对人员和实验室的要求、可操作性样本的运输、保存、样品量质量控制：污染控制、室内控制和室间控制自动化操作程度检测时间,病毒载量测定的基本要求,仪器需要按公司要求的进行定期维护加样器的校准水浴箱的温度校准实验室的处理检测实验室的分区,婴幼儿HIV感染核酸检测,HIV感染产妇所生婴幼儿在出生后18个月内可应用HIV核酸（DNA或RNA）检测进行早期HIV感染诊断。尽管HIVRNA检测敏感性在感染早期较高（出生后1个月内），但是HIVDNA检测不受母亲围产期抗逆转录病毒治疗和人乳汁中抗逆转录病毒药物以及婴幼儿预防性抗逆转录病毒治疗的干扰而影响早期诊断。另外，考虑母亲血液污染因素，不推荐使用脐带血进行HIV核酸检测。,适用范围,未满18个月的HIV感染产妇所生婴幼儿；未满18个月的婴幼儿，其母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染者,检测程序及结果报告,滤纸片载体及其特性（1）,作为血液载体，滤纸应具备极强的吸水性、厚度均一、液体流速一致、纯度高、没有污染、FDA在册，据不同的检测需求选择不同类型的滤纸。,滤纸干血斑样本特点（1）,需要样本量少，仅50-100l；易采集，末梢血即可，适用婴儿和静脉采血困难者；样本安全，生物危险性低，费用低廉的运输方式，可直接邮寄，被IATA归入最低危险水平；室温保存减少了保存费用，密封袋中加干燥剂和湿度指示剂.,滤纸片载体及其特性（2）,*903滤纸上的样本可在-20长期保存，蛋白的保存时间依据特异蛋白特性，见后。,滤纸片干血斑作为一种有效载体在HIV检测中具有非常重要的作用,定性检测HIV抗体定量检测HIV的病毒载量HIV耐药性检测HIV新发感染的检测快速检测的一种质控手段定性检测前病毒DNA,婴幼儿早期诊断,HIV耐药检测,抗病毒治疗的效果：大幅度降低病毒载量提升CD4细胞数改善症状，延长生存期。,抗病毒治疗存在问题：毒副作用大患者依从性差耐药性毒株的出现,什么是HIV耐药性？,HIV耐药性是指病毒通过自身的遗传变异，产生对药物抑制作用敏感性降低或不敏感的现象。,AvailableAntiretroviralAgents,NucleosideAnalogsAZT,zidovudine,RetrovirddI,didanosine,VidexECddC,zalcitabine,Hividd4T,stavudine,Zerit3TC,lamivudine,Epivirabacavir,ZiagenFTC,emtricitabine,EmtrivaNucleotideAnalogstenofovir,VireadNonNucleosideRTinhibitorsdelavirdine,Rescriptornevirapine,Viramuneefavirenz,Sustivaetravirine,Intelence,ProteaseInhibitors13.indinavir,Crixivan+/-r14.saquinavirInvirase+r15.ritonavir,Norvir16.nelfinavir,Viracept17.lopinavir+r,Kaletra18.atazanavir,Reyataz+/-r19.fos-amprenavir,Lexiva+/-r20.tipranavir,Aptivus+r21.darunavir,Prezista+rFusionEntryInhibitors22.enfuvirtide,FuzeonCCR5Entryinhibitors23.maraviroc,SelzentryIntegraseinhibitors24.raltegravir,Isentress,药物的作用机制,核苷类逆转录酶抑制剂：被靶细胞的细胞酶磷酸化后，以三磷酸的形式与天然三磷酸竞争，从而参与病毒DNA的合成，由于该抑制剂经化学修饰，将导致病毒DNA链合成终止。,药物的作用机制,非核苷类逆转录酶抑制剂：是一组结构多样化的化合物，通过非竞争性的方式结合于或者接近于病毒逆转录酶的活性位点，从而抑制病毒逆转录酶的活性。,药物的作用机制,蛋白酶抑制剂：肽类似物，通过结合于病毒蛋白酶的活性位点来抑制酶的活性，使之不能将病毒合成的多聚前体蛋白水解为病毒的各种结构蛋白和酶的组成部分。,耐药性是怎么产生的？,一、病毒本身的因素内因1.1HIV的逆转录酶（RT）不具有DNA聚合酶的校正功能，因此，在复制过程中，病毒核酸表现出高度的错误倾向性。1.2在病毒的高速复制过程中，高频率突变在很短的时间内随时发生,耐药性是怎么产生的？,二、药物的选择压力外因1.1在药物选择的压力下，耐药变异株完全取代药物敏感株最快能发生在14至28天内。1.2耐药株是在病毒自发的、高频率的基因突变中产生的，在药物选择性的压力下优势复制的结果。,哪些因素促使耐药性病毒株出现？,1.病毒载量2.服药的依从性3.药物的配伍不当4.其他因素：胃肠道吸收不好，随意间歇服药，与中药或其他药物同时服用。,HIV-1耐药检测的意义,耐药监测用于HIV-1感染人群和抗病毒治疗人群的耐药性监测和检测。用于新近感染人群的耐药性监测，了解耐药毒株流行的情况，并采取防控措施，用于治疗前人群的监测，指导制定一线抗病毒治疗方案；用于抗病毒治疗人群的耐药性监测，进行HIV-1耐药发生、发展趋势以及影响因素的分析，指导和完善大规模公共卫生模式抗病毒治疗的程序，以及制定二线治疗方案。耐药检测用于个体患者的耐药检测。在抗病毒治疗前进行耐药检测，可指导临床医生制定抗病毒治疗方案，保证抗病毒治疗的效果；在抗病毒治疗过程中进行耐药检测，可指导临床医生分析治疗失败的原因，并制定补救治疗方案,如何检测耐药株？,目前耐药性检测有2种方法：表型检测和基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的费用低，技术也相对容易，可在样品收集后12周得到结果，但分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物及其他药物的交叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测可以通过直接检测病毒的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，因此目前国际上广泛运用于临床的是基因型耐药检测。,表型检测方法,表型耐药性检测,克隆病毒RT、PR基因,分离病毒,在药物存在的情况下培养,计算IC50,插入含报告基因的骨架病毒,转染细胞,在药物存在的情况下培养,计算IC50,改良方法,传统方法,表型耐药性检测,优点：直接定量测定耐药性结果容易解释有临床临界值（cut-off)可立即检测对新药的耐药性缺点：操作复杂、价格昂贵、耗时长,HIV基因型耐药性检测,（序列测定法）,基因型检测方法（序列测定法）,病人血浆标本,HIVRNA,病毒cDNA,HIVRT和PR基因片断,序列测定,结果解释,RNA提取,逆转录,PCR扩增,特定的解释系统,标本,新鲜EDTA抗凝血浆，或-80保存，避免反复冻融。,病毒RNA提取（Qiagen公司试剂盒）,裂解标本，灭活RNA酶,加到离心柱中，RNA与硅胶膜结合,洗两次，去除杂质,用无RNA酶的缓冲液洗脱RNA,收集RNA备用,优点：操作简便、快速、得率高,核酸扩增类试剂的操作主要步骤,核酸（DNA和RNA）的扩增扩增产物的检测,HIV-1耐药基因型解释系统,提供HIV-1耐药基因型检测数据分析和解释系统（HIVDRDB）的主要机构有：国际艾滋病协会TheInternationalAIDSSociety-USA(IAS-USA)美国斯坦福大学TheHIVDrugResistanceDatabase(StanfordUniversity)法国国家艾滋病研究署TheFrenchANRS(NationalAgencyforAIDSResearch)比利时Leuven大学Rega医学研究所RegaInstituteforMedicalResearchinKatholiekeUniversiteitLeuven(REGA),耐药性突变记分,高度耐药：大于60分中度耐药：3059分低度耐药：1529分潜在低度耐药：1014分敏感：09分,HIV-1耐药性检测的临床指征,1.抗病毒治疗病毒类失败需要改变抗病毒治疗方案时应进行耐药性检测以协助选择有效的抗病毒药物。2.抗病毒治疗病毒载量下降不理想时可进行HIV-1的耐药性检测。3.抗病毒治疗失败需要进行耐药性检测时，应该在病人仍在服药时或停药后立即（4周内）进行检测。,HIV-1耐药性检测的临床指征,4.急性HIV-1感染的病人进行抗病毒治疗，最好进行耐药性检测，对于选择合适的抗病毒药物、取的最佳抗病毒效果很有益处。5.对于未经抗病毒质量的慢性HIV感染者不一定要做耐药性检测，但当有迹象显示感染的是耐药性HIV毒株时（例如感染来自于正在服用抗病毒药物的病人），就应当进行耐药性检测。6.不推荐对病毒载量1000CP/ML的病人做耐药性检测，因为病毒水平太低很难扩增出目的基因片段。,耐药性检测结果的解释,1.HIV-1的耐药性不是全或无的现象，基因型和表型耐药性检测结果的分析和解释都有困难。2.所有的抗病毒治疗都是联合用药，他们之间是相互协同的，即对一种药物的敏感性降低并不干扰同一治疗方案中其他药物的抗病毒活性。3.药物即使有耐药性也可能有益处，因为有耐药性突变的病毒比敏感毒株的复制适应性要差得多。4.血清中药物的水平，特别是蛋白酶类药物是高度变化的，如果能够提高血清中蛋白酶类药物的浓度，低水平的蛋白酶耐药性有时能够被克服。,耐药检测在临床中应用,儿童HIV感染的诊断,儿童感染HIV的途径,大部分儿童感染HIV是由母婴传播。宫内经胎盘传染、产时分娩过程中创伤性操作和经产道分泌物传染、生后母乳喂养经乳汁传染。血液传播,儿童艾滋病的流行病学特点,全世界已有百万儿童感染了HIV。7590%的小儿感染的