组织工程2015.ppt

组织工程TissueEngineering,何留民Email:jnu_lmhe,学历新加坡国立大学联合培养博士(2007-2008)中山大学博士高分子化学与物理(2006-2009)郑州大学学士高分子材料与工程(2000-2004)工作经历2012-2014香港大学香江学者2009-至今暨南大学副研究员2008-2009新加坡国立大学研究员研究方向生物医用材料、组织工程、药物载体。纳米医学在神经再生中的应用。,参考书目,1.B.O.帕尔森，S.N.巴蒂亚组织工程科学出版社2.柏树令，顾晓松，张传森组织工程学教程人民军医出版社3.姚康德，尹玉姬组织工程相关生物材料化学工业出版社,学习方式,课堂学习学术讲座实验课程(8-13周),评分方式,平时成绩：30考试：70%,主要学习内容,组织工程学概述生物支架材料种子细胞与培养组织工程的免疫学基础组织工程产品与临床应用组织工程动物实验技术,组织工程概述,何谓组织工程?为何要发展组织工程?如何进行组织工程?,WHAT,WHY,HOW,何谓组织工程,最早由美籍华人学者冯元祯（Y.C.Feng）教授提出“组织工程学”。,WHAT,Feng,Y.C.,1987年美国国家科学基金会根据冯教授的建议，正式采用“组织工程学”这一术语来描述这一新兴的领域，并正式建立了这门新学科。,“组织工程学”定义：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物正常及病理两种状态下组织结构与功能关系的基础上，研究和开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。,“组织工程”在2000年5月美国时代杂志中被列为未来十大热门工作的榜首。,组织工程的多学科交叉特点,材料科学,细胞生物学,化学,生物,流体力学,结构力学,表面物理,高分子,干细胞,发育,信号转导,组织工程,生物学家：利用已知的对动物胚胎发育成组织、器官的研究成果所获取的经验知识，进行组织器官的体外再生。材料学家：对人体组织的材料学特性进行详尽的研究，了解其关键的参数和性质，以此为基础，设计组织替代物，保证其材料学特性与人类自体组织完全相同。,关于组织工程,关于组织工程,工程师：研究人体组织的力学特性，然后利用这些特殊性质设计一个有限元的数学模型，预测组织器官如何随年龄及其它条件变化。外科医生：寻找一类新的生物大分子或细胞表型，通过外科手术植入到组织损伤部位，使不能自然愈合的损伤再生或加速其愈合过程。分子生物学家：通过对人类基因组计划的研究或其它途径，了解人类的全部基因信息，并找出那些控制组织形成和再生的基因序列，然后将其引入到原代细胞，进而形成可以制造组织的细胞系。,圣葛斯默和丹米安奇迹般地治愈了腿的移植。MasterofLosBalbases，约在1495年。,“狗腿子”的故事,传说中的“组织工程学”,组织工程主要是致力于组织和器官的再生与形成，利用生命科学和材料科学的进步，在一个模仿组织与器官形状的材料中种入细胞，使细胞依照模型来长成新的组织与器官，以供修复人体的组织或器官缺损。,核心：建立由细胞和生物材料构成的三维复合体,尝试人造耳,中国青年学者曹谊林教授于1996年在世界上第一个成功地在裸鼠背上培养制成了人形耳廓软骨支架，因而获得美国整形外科最高荣誉巴莱脱勃朗奖。,组织工程的科学目标,在细胞水平和分子水平构建具有生命力的生物体，也即组织和器官的形成和再生。,组织工程的应用目标,组织工程的应用目标是提高人体健康、长寿和生命的质量。组织工程的直接目标则是从形态、结构和功能上对组织、器官功能障碍或丧失进行永久性地置换和替代。,组织工程远期目标,建立具备与人体自身组织、器官相同生命功能的组织工程产品生产基地，使各类组织缺损、病变和器官衰竭患者能随时在组织工程产品的“超级市场”购买所需要的“产品”。,为何要发展组织工程?,组织、器官的丧失或功能障碍是人类健康所面临的主要危害之一，也是人类疾病和死亡的主要原因。,WHY,美国每年有数以百万计的人发生各种组织或器官的功能障碍或丧失，需进行800万人次手术修复，年耗超过400亿美元。由于移植物来源有限，只有不足2%的患者能及时治疗。,组织工程产品需求,假肢年销售额50100亿人工关节2亿/年（Zimmer公司2000套，获利5000万）烧伤植皮几百万/年骨/软骨300万/年关节置换100万例/年晚期肾病612万例/年，年花费$150亿肾透析70170人次，肾移植2000人次人均年透析治疗费用3万美元,目前美国组织工程产品市场8亿美元主要为组织工程皮肤，组织工程骨、软骨类产品,我国是人口大国，形势更加严峻。因创伤和疾病造成的组织、器官丧失或功能障碍病例据世界各国之首.,传统器官修复途径（加定义）,自体组织移植拆东墙补西墙，以伤养伤异体组织移植免疫反应，供体严重不足人工代用品异物反应，癌变，致畸,需修复的器官、组织,可供移植的器官、组织,供需矛盾尖锐！,于是.,应运而生,组织工程,组织工程的优点,对病损组织进行形态、结构和功能的重建；可永久性替代；可进行大块组织缺损的修复；可对组织器官缺损进行完美的形态修复；其他.,组织工程人类组织和器官的制造业,组织工程科学意义,不但可以从细胞水平和分子水平认识生命的本质，而且能够从整体上优化生命的质量，并把握生命的进程。同时组织工程研究理论体系和研究方法不仅是针对哺乳类动物，而且可拓展到植物上去，这对于促进农业、工业和军事科学的发展都将有着不可估量的深远意义。,组织工程科学意义,多学科交叉的边缘学科特点，除了具有生物力学、生物材料学和细胞与分子生物学三大学科支撑外，融汇了生物信息，生物化学工程、遗传学及工程、生物电子学及计算机的原理和方法；组织工程的研究，必将促进相关高技术产业的交叉、渗透和发展，同时还可以演化或衍生出新的高技术产业；组织工程将是21世纪最具有潜力的高技术产业，必将产生巨大的社会效益和经济效益。,组织工程研究历史与现状,Vacanti(b)8w;(c):10w,PLGA85/15,PLGA65/35,PLGA55/45,(a):0w;(b)4w;(c):10w,(a):0w;(b)2w;(c):4w,2w,0w,85/15,75/25,65/35,55/45,体外降解外观变化,PLGA多通道神经导管体外降解,1W,4W,12W,0W,1W,4W,聚己内酯polycaprolactone,PCL,常规的催化剂是Sn(oct)2，反应温度140-170,熔融本体聚合。根据聚合条件的改变，分子量可从几千到几十万lewis和其它有机酸也可作为催化剂，但合成的PCL分子量分布较宽（阳离子聚合）稀土络合物也可作为催化剂，特点是PCL分子量分布窄，可合成超高分子量的PCL。,PCL合成条件,CL纯化：在CaH2下减压分馏，收集在装有干燥分子筛的容器中反应瓶150预先干燥18h，然后在充满干燥氮气的手套箱中冷却。反应温度140-150，时间18-24h产物用二氯甲烷溶解，过量甲醇沉淀链控制剂一般为水、伯醇、胺以及其它一些含有活泼氢的化合物，线性高分子可用官能度为1或2的醇如正十二烷醇或1,6-己二醇；枝状高分子可用官能度大于2的醇如季戊四醇、三羟甲基丙烷以及各种糖等制得。,PCL性质,PCL半结晶的聚合物，Tm60，结晶度45%，Tg60良好的通透性和柔韧性（断裂伸长率300600%）良好的热稳定性（分解温度350）良好的加工型和力学性能生物降解性（泥土中微生物作用下降解，在空气重降解很慢）形状记忆特性,PCL形状记忆材料在矫形外固定、骨折绷带、癌症放射治疗时的定位等,PCL-PDS形状记忆缝合线,PCL-b-PLLA,PCL的环境降解表面蚀解,PCL单丝泥土包埋降解：10m长，地面10cm深,丝状真菌是生物降解的主要原因。,泥土包埋前,包埋后1month,包埋后2months,聚磷酸酯（polyphosphoesters，PPEs）,聚磷酸酯是分子骨架上连有磷酸酯键、类似于生物大分子比如核酸和磷壁质酸的高分子材料。比如多聚磷酸酯（polyphosphate）、聚膦酸酯（polyphosphonates）和亚磷酸盐（polyphosphites：MPO3，M2HPO3，M4P2O5）等，统称为聚磷酸酯polyphosphoester（PPE）。它具有结构多样性，生物可降解性，良好的生物相容性及在生理条件下的可酶解性。因而它在药理和生理上得到广泛的应用。由于分子链中存在有5价的磷原子，这就允许具有生物活性的分子连接到链上，从而增加了改变聚合物物理化学性质的自由度。同时也改变了分子链的骨架结构。如图所示：可以改变R和R，从而在宽的范围内改变PPEs的物理化学性质。,聚磷酸酯近来主要用于基因传递（genedelivery）和组织工程（tissueengineering）中生长因子的控制释放方面。,MajorstagesofDNAdeliveryintothecellandintracellulartransport,聚(有机）磷腈poly（organo）phosphazenes,聚磷腈是一类由N、P原子通过单、双键交替连接的具有无机主链的聚合物，通过侧链衍生化引入性能各异的有机基团可以得到理化性质变化很广的高分子材料。其生物相容性好，具有生物降解性。,R基团可以是烷氧基、芳氧基、氨基、烷基、杂环、无机和有机金属单元,其它聚酯,聚醚酯,1,4-二氧杂环己烷-2-酮,1,5-二氧杂环庚烷-2-酮DXO,1,4,6-三氧杂螺4,4壬烷,支架细胞的家,什么样的家才是细胞的理想家园？,为什么细胞需要一个家,人类是由一个胚胎细胞不断地分裂、成长、分化而成，共同功能的细胞组成组织，不同群的组织形成有特殊功能且结构复杂的器官，而器官连接形成系统，各种系统的整合运作使生理机能发挥效果，如此构成一个完整的身体。想让细胞长成我们所预期的器官构造，如果缺乏细胞的立足点，也就是作为细胞生长温床的“支架”，是一件不可能完成的任务。,组织工程是依循人体组织生长发育的模式，利用特殊的生物高分子材料建构出三维空间的立体框架，让植入的细胞可以在其中生长并增生。提供近似体内的生长环境和营养给未完全分化的细胞，如干细胞，使这些细胞分裂、生长、及分化成具有特定功能的细胞，进而繁衍成所需的组织，甚至培养不同功能的组织，以形成具有特殊功能的器官。支架的功能不仅仅当作细胞生长的框架结构，更可以进一步地控制引导细胞朝特定的方向生长、分化。,理想的组织工程支架材料的要求,良好的生物相容性：无毒、不致畸，利于种子细胞的黏附、增殖，降解产物无毒、无炎症反应；良好的生物降解性：完全降解，降解速率与组织细胞生长速率相适应，降解时间可认为调控；具有三维多孔结构：材料具有合适的孔径、高孔隙率(90以上)，较高的内比表面积，有利于细胞的黏附生长，血管和神经的长入，有利于新陈代谢；具有良好的可塑性：材料可预先制成一定的形状；具有一定的机械强度；良好的材料细胞界面：利于细胞黏附、增殖，激活细胞特异基因表达，维持细胞正常表型表达。,组织工程支架材料,支架构建,致孔剂致孔,形成气体的盐致孔水溶性致孔剂致孔冰晶致孔,PLLA三维海绵支架形貌,控制因素,致孔剂形状支架孔形貌致孔剂尺寸支架孔径致孔剂用量支架孔隙率,粒径500m粒径500m,不同大小NaCl颗粒为致孔剂的共混多孔支架形貌,热致相分离,A:metastableregionB:unstableregion.,参数:溶液浓度、冷冻温度、冷冻时间和冷冻速率等,固-液相分离,PLLA/二氧六环,横截面,纵截面,溶剂,冰醋酸,二氧六环,PLGA,浓度,PLGA/二氧六环,温度,PLLA/二氧六环,-30C,-80C,-196C,小口径血管,温度,PLLA/THF体系L-L相分离制备纳米支架,相分离与半晶质聚合物结晶同时进行,温度/溶剂,PLLA/二氧六环/水,温度/溶剂,PDLLA/二氧六环/水,温度/溶剂,PLGA/二氧六环/水,乳液冷冻干燥,Polymer1995,36:837-42,超临界流体Supercriticalfluid,SCF,液体，气体和超临界流体的比较,各种化学物质的临界压力、温度和密度,接近临界点时，压力或者温度的小变化会导致密度发生很大变化，因此使得超临界流体的许多特性可以被“精细调整”。超临界流体适合作为工业和实验室过程中的溶剂，而且可以取代许多有机溶剂。,超临界流体技术制备组织工程支架,超临界流体发泡工艺图,无残留溶剂制备非晶相聚合物支架参数：压差、减压速率,SEMofthefoamedPEMA/THFMAdiscshowingthenon-porousouterskin.SEMofoneofthefoamsfollowingremovaloftheouterskin.,组织工程纳米支架,不同层次的组织工程,组织工程应该在宏观（超细胞100m和细胞10m）、微观（亚细胞0.110m)和纳观（6mm)替代人体大中动脉已获得广泛成功；小口径血管(3-5cm)（感觉/运动）功能性恢复中枢神经系统足够数量轴突及其引导胶质瘢痕及抑制因子的克服轴突生长跨过宿主-移植物界面合适的功能联系,组织工程化神经及其材料有效性评价,体外评价细胞相容性:S100免疫组化标记雪旺细胞生长和迁移，MTT或者AlamarBlueTM验证细胞活力轴突生长：背根神经节细胞,体内评价实现缺损神经功能的最佳恢复是体内评价的标准形态（计量）指标功能指标,实验动物：大鼠10-15mm坐骨神经缺损，更长距离选择兔、猫、绵羊、猪、狗、猴,神经再生评价：电生理检测，组织学观察，计量学分析,组织工程化神经相关产品开发,可降解合成聚合物类：neurotubeR（PGA），已获得FDA和CE认证可降解天然聚合物类：neuroGen，获得FDA认证合成-天然聚合物复合：壳聚糖-PGA（中国），PGA-胶原导管（日本）不可降解合成聚合物：硅胶管，ePTFE神经导管,组织工程化器官面临的困难与不足,如何诱导分化出指定的器官。体外培养毕竟不同于自身“原配”。培育时间较长。有赖于发育及信号转导的进一步发展。,组织工程产业化研究,组织工程产品属于生物制品，需研究标准化批量生产的工艺、包装、贮存、运输、人体植入前处理、植入后监测等产业化过程，同时研究审批程序、机构，以及制定相应的政策法规。在这些科学问题解决之后，组织工程产品将会被推向市场。对市场前景的预测又将是政府及企业界投入组织工程研究的动力。因此在某种意义上，对未来市场的预测将会推动组织工程学的开发与研究。,组织工程学研究与经济发展的关系,据Vacanti及Ianger的一项调查表明，美国每年花在有器官及组织损害病人身上的资金高达4000多亿美元，几乎占全美国医疗费用的一半。美国的医院每年要为这些病人作800万例次手术，然而并不能挽救每一个人的生命或避免残废。每年约有4000人在等待器官移植时死亡，还有约10万人在未被列入等待器官移植时就已死亡。用于骨缺损修复的骨移植手术在美国务医院是仅次于输血的组织移植手术。,组织工程学前景广阔,约有1,000万人因尿道功能失调，尿失禁或尿液返流，等待组织工程产品植入治疗；约有100万个膝关节半月软骨等待替代；每年有1,000万例牙科手术，其中需新放入9,000万个充填物，另有2亿个过去放入的充填物需要更换。每年约有200万例以上的皮肤慢性溃疡，其中50万例系糖尿病性肢体缺项血，需要组织工程化皮肤移植治疗。,组织工程产业化速度突飞猛进,2000年,在世界范围内有73家生物技术公司,到2002年发展为89家,到2003年发展到176家。几乎所有重要组织的构建均有报道,甚至亦有肾脏、肝脏、心脏等重要生命器官初步构建的研究报道,显示出组织工程研究的飞速发展。,从事组织工程生产的公司,其产品可分为4类:(1)细胞类,如干细胞/治疗性克隆、微囊化细胞治疗;(2)代谢类,如生物人工肝、生物人工肾、生物人工胰腺;(3)结构类,如皮肤、心血管、骨骼肌;(4)其它类型。,上述组织工程产品中,组织工程皮肤、组织工程软骨和组织工程骨等在美国、德国、英国、法国、荷兰、意大利等国家都有多种产品上市。目前,FDA已批准并公布了八种组织工程皮肤产品:Biobrane(1989)、Alloderm(1996)、TransCyte(1997)、Apligraft(1998)、Dermagraft(2001)、OrCel(2001)、Promoran(2002)、Intergra(2002），和一种组织工程软骨Carticel(1997),还有多种产品处于临床试验之中。,国内组织工程产业化概况,到2005年,组织工程相关课题已申请国内专利137项,获得国内专利44项;申请国际专利15项,获得国际专利1项;新成果累计推广到200家医院,产生经济效益2800余万元。,2005年10月召开的两个具有历史性意义的组织工程学盛会亦备受世人瞩目:以再生医学为主题的第264次香山科学会议,将组织工程学确立为再生医学的基础及核心内容;而上海国际会议中心召开的第八届国际组织工程学会（TESI）年会,是TESI第一次在发展中国家举行的年会,显示了中国在国际组织工程领域的重要地位。,第四军医大学的组织工程皮肤(商品名:安体肤,西安艾尔肤公司)获得了国家食品药品监督管理局(SFDA)颁发的我国第一个组织工程产品注册证书(国食药监械准字2007第3461110号),标志着我国组织工程产品开始进入产业化阶段,是组织工程研究领域的标志性成果。,至2007年底,已进入临床试验的产品：组织工程角膜(北京科宇联合干细胞生物技术有限公司)、神经修复材料(首都医科大学、南通大学);,已经受理注册检验的产品：组织工程皮肤：第三军医大学、上海组织工程中心、华北制药集团有限责任公司组织工程骨：四川大学、上海组织工程中心、第三军医大学组织工程软骨：关节动力安达(天津)生物科技有限公司、杭州龙禧生物医药科技有限公司组织工程肌腱：四川大学组织工程神经：中山大学组织工程细胞和组织冻存保护液：山东威高集团医用高分子制品股份有限公司,组织工程产业化面临的问题,虽然组织工程产业硕果累累,但组织工程产品的市场还很小,全球组织工程皮肤的市场在2千万美元左右,而组织工程软骨的市场不会高于4千万美元。相反,那些不含活细胞的生物材料在皮肤溃疡、软骨修复和骨修复的临床治疗和市场中却有较好表现。,因此,即便是全球领先的、美国最早和最大的两家组织工程皮肤生产商OrganogenesisInc和AdvancedTissueScience也已申请破产保护,而有些组织工程皮肤产品,如CellActiveSkin、Epidex、BioSeeds和MelanoSeed等也因严重亏损而停产。,到2000年底,美国总共受理了20个组织工程产品,其中4个产品(Apligraft皮肤、Carticle软骨、Dermagraft皮肤、Orcel皮肤)得到批准,但是都没有在商业上取得成功;6个产品申请失败或没有得到批准;10个产品正处于临床实验中。,而获得批准产品的4家公司又都遇到了一些挫折:出品Apligraft产品的Organogenesis公司已经破产;出品Dermagraft产品的AdvancedTissueScience公司经营断断续续,其产品将被SmithNephew公司销售;出品Orcel产品的Orcel公司财政上已经出现危机