第三章-基因芯片的制作方法

第三章基因芯片的制作方法,3.1概述,1.基因芯片是以Southern印迹杂交技术为基础发展起来的。反向杂交技术,2.基因芯片的制作方法：原位合成法：Affymetrix公司直接点样法（合成后点样）：Stanford大学，1995年,1.常见的载体类型膜玻片三维基质包被玻片,3.2芯片载体的制作,（1）膜优点：与核酸亲和力强。缺点：单位面积上点样密度低；背景较高；灵敏度低。,（2）玻片优点：耐受高温和高离子强度；具有不浸润性，提高点样密度；背景低。缺点：二维的平面结构，与DNA杂交时会有空间位阻。,（3）三维基质包被玻片具有三维孔性结构，更适合做蛋白质芯片的支持物，可以保持蛋白质的空间构象，不影响它的活性。,2.玻片的修饰类型氨基修饰玻片同型双功能偶联剂修饰的玻片硫醇基修饰的玻片环氧硅烷化修饰的玻片等,图3-3APS修饰玻璃表面反应示意,（1）氨基修饰的玻片,羟基,氨基,对苯乙异硫氰酸,（2）同型双功能偶联剂包被修饰的玻片,异硫氰基,醛基,戊二醛,连接分子,手臂分子,特异性探针,图3-7SMPB连接硫醇基核苷酸和氨基玻片,（3）连接硫醇基修饰的玻片,硫醇基,图3-8环氧硅烷化玻片修饰示意,（4）环氧硅烷化修饰的玻片,环氧硅烷基,1.cDNA探针2.寡核苷酸探针3.基因组DNA探针（很少用）4.RNA探针,3.3探针的制备,cDNA探针：主要来自cDNA文库，从细胞或组织中提取RNA后逆转。,寡核苷酸探针：根据数据库中的基因序列人工合成的。通常在5末端进行氨基修饰，并加入一段不直接参与杂交的重复序列，称为手臂分子，通常用polydT(10)。,手臂分子,特异性探针,探针分子与基片表面的作用方式化学偶联：探针分子与基片表面活性基团发生化学反应，生成新的共价键。物理吸附：探针分子与基片表面通过次级键相连接。,3.4点样仪及点样过程,接触式点样非接触式点样,1.接触式点样点样针。基本过程：点样针接触探针溶液，通过浸润现象或毛细现象，使液体转移到针尖或针的狭缝中。针尖再接触基片，样品在基片上留下斑点，完成一次点样。,点样针的种类：实心针（solidpin）裂隙针（splitpin）毛细管针（capillarytube）针与环（pinandring）,best,2.非接触式点样（自学）（1）微螺线阀（2）压电元件,接触式,非接触式,图3-10当前59家芯片设备生产商使用的点样针分布情况（图中的数字代表使用各点样针的厂家数目）,3.5原位合成法,操作平台,Affymetrix芯片的特点：光导原位合成的寡核苷酸芯片高密度的点阵技术独特的PM-MM探针设计,1.光导原位合成原理,2.高密度的点阵技术,1平方厘米的面积至少可排列上百万个探针合成区（“点”),3.Affymetrix独特的PM-MM探针设计,图3-11PM-MM探针设计方案,高灵敏度,图3-12仅用PM探针与联合应用PM-MM探针检测靶序列的灵敏度比较,芯片结果准确可靠,图3-13PM-MM的多个探针的结果与单个探针的结果比较,4.光导原位合成法的缺