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文档简介
第三章生物制品的制备(Preparation)第一节一般生物制品的制备方法(Preparationofgeneralbio-preparate)一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法(Selection、pretreatmentandpreservationofrawmaterialofbiopreparate),(1)原料选择原料的选择原则:有效成分含量高,新鲜;原料来源丰富,产地较近;原料中杂质含量少;原料成本低等。,原料的选择注意事项:植物原料生长的季节性;微生物原料的对数期;动物原料的年龄与性别。,(2)原料的预处理与保存:动物原料:采集后要立即处理,去除结缔组织、脂肪组织等,并迅速冷冻贮存。植物原料:要择时采集并就地去除不用的部分,保鲜处理;微生物原料:要及时将菌细胞与培养液分开,进行保鲜处理。,原料的保存方法主要有:冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用-40速冻。有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料,如脑垂体等。防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料,如发酵液、提取液等。,二、生物制品的提取(extraction)(1)生物组织与细胞的破碎(obtrudeoftissueandcell):生物制品大部分存在于生物组织或细胞中,要提高提取率,破碎过程是非常重要的。常用的破碎方法:磨切法,该法属于机械破碎方法,设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等。压力法,有加压与减压两种,常用的法兰西压釜使用效果良好。,反复冻融法,设备简便,活性保持好,但用时较长。超声波振荡破碎法,该方法破碎效果较好,但由于局部发热,对活性有损失。自溶法或酶解法,用得较少。,(2)提取(extraction)生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时,首先要根据活性物质的性质,选择提取试剂。提取试剂主要有:水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂(如氯仿、丙酮等)。考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。注意提取的温度、pH、变性剂等因素。,三、分离纯化的基本过程,四、分离纯化的基本技术(1)分离纯化技术应满足的要求技术条件要温和,能保持目的产物的生物活性;选择性要好,能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来,达到较高纯化倍数;收率要高;两个技术之间要能直接衔接,不需要对物料加以处理或调整;分离纯化过程要快,能够满足高生产率的需求。,2.细胞破碎与固液分离(1)细胞收集常用离心分离的方法;膜过滤法也逐渐得到广泛应用。(2)细胞破碎有机械破碎法和非机械破碎法。(3)固液分离分离细胞碎片是比较困难的,可以用离心、膜过滤或双水相分配的方法,使细胞碎片分配在一相(通常为下相)而分离,同时也起部分纯化作用。,3.目的产物的分离纯化分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术是下游精制阶段的常用手段,该法优点是具有多种多样的分离机制,设备简单,便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱等。,第二节各类生物制品的分离纯化方法,蛋白质核酸糖类脂类氨基酸,一、蛋白质类制品的分离纯化方法(Isolationanddepurationofproteinproduction)包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有:(1)沉淀法(precipitation):蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破坏,从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法(saltingout)、有机溶剂沉淀法(organicsolventprecipitation)、等电点沉淀法(isoelectricprecipitation)、与靶物质结合沉淀法(如抗体抗原)(targetbandingprecipitation)等。,(2)按分子大小分离的方法:有超滤法(ultrafiltration)和透折法(dialysis)(即膜分离方法)、凝胶层析法(gelchromatography)、超速离心法(ultracentrifugation)等。其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。,(3)按分子所带电荷进行分离的方法氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们具有等电点,在离开等电点的pH时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电点为7.0,当溶液pH为4.0时,分子则带有正电荷。由于具有该性质,利用带电性质进行分离是极其有效的方法。利用电学性质进行分离的方法有离子交换柱层析法(ion-exchangechromatography)、电泳法(electrophoresis)、等电聚焦法(isoelectricfocusing)等。,(4)亲和层析法(affinitychromatography)大部分生物活性物质都有其作用的靶物质,如酶与底物(或抑制剂)、抗原与抗体、激素与受体等,它们之间有特异的亲合作用,利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。亲和层析分离专一性强,操作简便,是当前应用很广泛的分离方法之一。另外,最近出现的新方法还有疏水层析(hydrophobicinteractionchromatography)等。,二、核酸类制品的分离纯化方法(Isolationanddepurationofnucleicacid)核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法。提取法生产DNA和RNA,先提取核酸和蛋白质复合物,再解离核酸与蛋白质,然后分离RNA与DNA。发酵法主要用于生产单核苷酸。,三、糖类制品的分离纯化方法(Isolationanddepurationofsugar)由于各种糖类制品的性质和原料来源不同,没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍多糖和粘多糖的一般分离纯化方法。,(1)提取方法(extraction)非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖,提取采用的溶剂是水或盐溶液。降解法(degradation)适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖(mucoitin)。如从软骨中分离提取硫酸软骨素(chondroitinsulfate),就是用碱处理进行降解。又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。,(2)分离方法(isolation)常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。乙醇沉淀法(alcoholprecipitation):是从提取液中沉淀多糖的最简易方法,也适用于分级分离。4-5倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐,如十六烷基三甲基铵(CTA)等。,离子交换层析法(ionexchangechromatagraphy):粘多糖的聚阴离子能够很好地被阴离子交换剂吸附和分离,如DowexI-X2(商品名)离子交换树脂、DEAE-离子交换纤维素(二乙胺乙基)等。洗脱可用NaC1溶液进行梯度洗脱。,四、脂类制品的分离纯化方法(isolationanddepurationoflipoid)(1)提取方法(extraction)脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极性脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的。提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏这种结合键,将脂质溶解出来。常用的溶剂有组合溶剂,醇是其中的主要成分,此外还有氯仿、甲醇、水等。,(2)纯化方法(depuration)沉淀法(precipitation):由于不同脂质在丙酮中溶解度不同,故常用它进行沉淀。吸附层析法(adsorptionchromatography):常用吸附剂有硅胶、氧化铝等。它是通过极性和离子力等把各种化合物结合到固体吸附剂上。洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行,非极性的先流出,极性的后流出。,离子交换层析法(Ionexchangechromatography):脂质分子的存在有非解离、两性离子和酸式解离三种状态。根据它们在一定pH条件下的解离情况,选择适当的离子交换剂可将它们提纯。如TEAE纤维素对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。,五、氨基酸类制品的分离纯化方法(isolationanddepurationofAa)(1)氨基酸的生产方法(productionofAa)蛋白质水解法(proteinhydrolysis):水解法有酸水解(acidhydrolysis)、碱水解(basehydrolysis)和酶水解(enzymehydrolysis)三种。,用盐酸水解为常用方法,其优点是水解迅速、完全,产物全部是L型氨基酸,缺点是色氨酸全部被破坏,丝氨酸等部分被破坏。碱水解法易产生消旋作用,较少应用。酶水解法水解不够完全。,发酵法(fermentation):菌株经过发酵后,从培养液中提纯氨基酸。化学合成与酶促合成法化学合成法一般得到的是DL型氨基酸,尚需要对异构体拆分;酶促合成法也是酶工程在医药工业上的应用,优点是技术工艺简单,转化率高,副产物少和易提纯等。,(2)氨基酸的分离方法(isolationofAa)有沉淀法(percipitation)、吸附法(adsorption)和离子交换法(ion-exchange)。沉淀法(percipitation):根据形成沉淀的原理不同分为两种:是依据不同氨基酸在水中或其他溶剂中的溶解度差异进行沉淀分离。是用特殊试剂沉淀某种氨基酸,如用邻二甲苯-4-磺酸与亮氨酸形成不溶性盐沉淀,再用氨水分解,使亮氨酸游离出来。,吸附法(adsorption):这是利用吸附剂根据氨基酸吸附力的差异进行氨基酸分离的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分离就是利用活性炭对其吸附的原理。离子交换法(ion-exchange):氨基酸是两性电解质,在一定pH条件下,不同氨基酸带电性质及解离状态是不相同的,因此在离子交换剂上被吸附的强度不同。常用的离子交换剂为强酸型阳离子交换树脂,洗脱主要用pH梯度洗脱。,第二节人体来源生物制品制备实例(Exampleofbio-preparationapplicationtohuman)一、人血浆白蛋白制剂的制备(preparationofhumanbloodplasmaalbumin)(1)结构和性质(structureandcharacter)人血是一种红色混浊的、具有一定腥味与粘滞性的液体。用适当的抗凝剂除去其中的有形成分(如红血球)而得到淡黄色、半透明的液体叫血浆。,血浆中除含有大量的水分以外,还含有血浆蛋白等溶质。白蛋白(albumin)又称清蛋白,白蛋白是血浆蛋白中含量最高(3.84.8%)、分子量最小、分子数最多的一类蛋白质。白蛋白对治疗因失血、创伤、烧伤等引起的休克,脑水肿和大脑损伤性所致的脑压增高,防止低蛋白血症,肝硬化或者由肾病引起的水肿与腹水等严重疾病具有良好疗效。,白蛋白为单链分子,由584个氨基酸残基组成,N端为天门冬氨酸,C端为亮氨酸,分子量为6.6104,在离子强度为0.15时,pI为4.7,易溶于水,在60%硫酸铵饱和度以上沉淀。对酸较稳定,受热变性。从人体中分离的白蛋白有两种:一种是从健康人血浆中分离制得的人血清白蛋白,另一种是从健康产妇胎盘中分离制得的胎盘白蛋白。,血(无抗凝剂)自然凝固分离出血清(无纤维蛋白酶原、凝血因子等),(2)工艺路线(图3-1),图3-1白蛋白生产工艺路线,利凡诺,NaHCO3,pH8.6,离心分离,络合物,蒸馏水,NaCl,HCl,弱酸性,40,离心,离心液,浓缩,超滤,浓缩液,灭活病毒,65,1h;60,10h,热处理液,除菌,除菌过滤,白蛋白液,干燥,冷冻干燥,白蛋白,去杂蛋白,人血浆(%),(3)工艺要点络合对于络合所要求的pH值,可以略高些,这样,白蛋白络合完全,络合物形成一个相当硬的块,倾倒上清液方便,损失少。但不能太高,以防络合血浆中的其它蛋白,影响解离与白蛋白制剂的纯度。若pH值偏低,络合不完全,络合物松软,甚至成汤状,不利于倾去上清液。血浆搅拌用NaHCO3调节pH至8.5-8.7之间,缓慢加入与血浆等体积的2.3%利凡诺溶液,边加边搅拌,充分络合后。静置24h,分离上清与络合物沉淀。,加入2.3%利凡诺溶液比加入5%利凡诺溶液的效果好?因为加5%利凡诺溶液常造成灭活时白蛋白部分变性或者分装困难。加入2.3%利凡诺溶液的体积一般不超过血浆体积的一半。这可能是加入利凡诺溶液除去了解离物中过多的Cl-而澄清,或者是加入的利凡诺(过量)使白蛋白与利凡诺的络合物反溶,从而使造成混浊的物质消失,达到澄清的目的。,解离生产中要严格控制溶液的温度。25左右室温,络合物形成一个硬块,利于去上清和解离。温度太低,虽然不影响络合,但络合物呈稀糊状,倾倒上清液时常会丢失部分络合物,而且络合物内残存较多的利凡诺的水溶液。解离温度要维持在40左右,是解离反应的最适温度。,解离液的pH值在1.281.45之间,解离效果良好。络合物中加入解离液并搅拌均匀后,将解离后混合溶液pH值控制在6.0左右较理想。以解离后解离混合溶液pH值决定加入解离液的体积。解离后解离混合液的pH值高于6.5时,表明加入的解离液少了,有部分络合物未被解离开;低于5.85,表明加入的解离液多了,解离过度。这两种情况下,解离效果均不佳。,在沉淀中加约二分之一血浆体积的灭菌蒸馏水解离所得到的络合物沉淀,将解离混合物溶液用0.5mol/LHCl调节pH至5.5-6.0,加NaCl至0.15%0.2%,充分搅拌、40过夜解离(8-10h)。,在生产过程中常发现,由于解离效果差,从而不能使生产过程顺利进行。方法:(1)加入活性炭法:在解离效果略差,即能够较顺利地离心,得到部分或全部稍混浊的滤液,但不能正常进行压滤时,加入适当的活性炭于滤液中,搅拦均匀后,立即离心,由于活性炭吸附溶液中粘稠物质,形成大颗粒,经离心可以除去杂质,起到澄清的作用。,(2)加入利凡诺法:在解离时,在由加入的盐酸或(和)盐过多而造成解离物的滤液混浊的情况下,变性前后,向解离物中加入适量的利凡诺溶液均会起到澄清的作用,而回收率却不会降低太多。变性前加利凡诺溶液比变性后加利凡诺溶液的效果显著。由于前者在变性过程中反应温度升高了,反应时间增加了。,(3)多次络合法如果解离效果极差,用以上两种方法处理都难以达到澄清的目的,那只有采取多次络合法,即在尽量除去解离物中粘稠物质后,将其pH值调至9.09.2,加入适量的5%利凡诺溶液,进行重络合,继尔重解离,一般都会得到很理想结果。如果仍然出现解离不良的现象,重复以上处理过程,直到得到满意的结果。这种方法使产品纯度高,外观变黄(棕),同时也使成本提高,回收率降低。,去杂蛋白:白蛋白具有生物活性,凡是使蛋白质变性的温度都会使白蛋白变性。65条件下变性1h,离心分离出上清液。热处理:在600.5条件下处理10h,灭活病毒。检验方法:冻干品白色疏松物体。白蛋白含量占95%以上,水分95%inonestep。配基(ligand):被固定在基质上的分子称为配基,配基和基质是以共价键结合的。基质(matrix):亦称为载体(vector),是构成固定相的骨架。,2)亲和层析有如下特点(CharacteristicsofAffinityChromatography),纯化过程简单、迅速;分离效率高;产物纯度高;必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件。因此应用范围受到一定的限制。,3)亲和层析的基本原理(MechanismofAffinityChromatography)亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂。当含有混合组份的样品(流动相)通过此固定相时,只有和固定相分子有特异亲和力的物质,才能被固定相吸附结合,其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出。然后改变流动相成份,将结合的亲和物洗脱下来。(见Fig1、Fig2)。,(Fig1.MechanismofAC),(Fig2.MechanismofAC),具有特异性亲和作用的生物分子4)配基的种类(sortsofligand)抗原与抗体。DNA与互补DNA或RNA(cDNA、mRNA)。酶与其底物。激素与其受体。维生素与结合蛋白。糖蛋白与植物凝集素。,5)亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的选择(selectionofvectors)多孔的立体网状结构,能使被亲和吸附的大分子自由通过。颗粒均匀,具有良好的流速。具有惰性,尽量减少非专一性吸附。在温和的条件下能与配基共价偶联。,6)常用的亲和层析载体(VectorsofAffinityChromatography)纤维素(cellulose)葡聚糖凝胶(Sephadex)琼脂糖凝胶(Sepharose)聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel)多孔玻璃珠(Bio-Glass)其它新型载体(Othergels),7)亲和层析配基的选择(Selectionofligand)1.纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力。2.但亲和力太高也是有害的,因为在解离配基复合物时所需的条件就要强烈,这样可能使生物分子变性。3.配基必须具有适当的化学基团,可用于和载体相连,同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力。,8)载体、配基、目的物的连接(Conjunctionofvector、ligandandtargetmaterial),载体(VectorsorMatrix)+配基(Ligand)+目的物(targetmaterial),FigACreliesuponareversiblehighlyspecificbindingreaction.,FigSpacerarmprinciple,Aspacerissometimesusedtoensurefullaccessibilityoftheaffinityligand.,FigPrincipleofpreparingACmedia,9)亲和层析的基本操作方法:,平衡(Equilibration)用平衡Buffer冲洗柱体,至基线平稳.,样品上柱和冲洗(Sampleapplicationandwash)样品中的目的物与层析介质选择性的吸附,杂质不被吸附。用上样Buffer冲洗柱体,杂质被冲洗下来。形成杂质峰(见下图)。,洗脱(Elution)选择适当的条件,将吸附在亲和介质上的目的物解吸下来(见下图)。,(4)凝胶过滤色谱(gelfiltrationchromatography)以具有空隙大小一定的多孔性凝胶作为分离介质,小分子能进入孔内,在柱中缓慢移动,而大分子不能进入孔内,快速移动,利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。,根据蛋白质的相对分子质量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异,可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。一是用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液二是用于蛋白质分子的分级分离,细胞因子的相对分子质量在1.5104,很容易分离纯化;另一个应用是用于去除产物的多聚体及降解产物。,四、选择分离纯化方法的依据1、根据产物表达形式来选择(accordingtoexpressionalformofproducts)分泌型表达产物的发酵液的体积很大、但浓度较低,必须在纯化前进行浓缩,可用沉淀和超滤的方法浓缩。,产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达之间的一种形式,它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质,在一定程度上有利于分离纯化。为了获得周质蛋白,E.coli经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透压休克的方法来获得,能够回收到高质量的产物。,E.coli细胞内可溶性表达产物破菌后的细胞上清,首选亲和分离方法。如果没有可以利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基,一般先用离子交换色谱,处于极端等电点的蛋白质用离子交换分离能去掉大部分的杂质。,2、根据分离单元之间的衔接选择(accordingtoligationofisolatedunit)应选择不同机制的分离单元来组成一套分离纯化工艺,尽早采用高效的分离手段,先将含量最多的杂质分离去除,将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。,即通常:先选用非特异、低分辨的操作单元(如沉淀、超滤和吸附等),以尽快缩小样品体积,提高产物浓度,去除最主要的杂质(包括非蛋白类杂质);采用高分辨率的操作单元(如具有高选择性的离子交换色谱和亲和色谱);凝胶排阻色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后。,色谱分离次序的选择同样重要色谱次序能够提高分离效率,当几种方法连用时,最好以不同的分离机制为基础,经前一种方法处理的样品应能适合于作为后一种方法的料液,不必经过脱盐、浓缩等处理。如经盐析后得到的样品,不适宜于离子交换层析,但对疏水层析则可直接应用。,离子交换、疏水及亲和色谱通常可起到蛋白质浓缩的效应凝胶过滤色谱常常使样品稀释在离子交换色谱之后进行疏水层析色谱就很合适,不必经过缓冲液的更换亲和层析选择性最强,但不能放在第一步:一方面因为杂质多,易受污染,另一方面,体积较大,需用大量的介质,因此亲和层析多放在第二步以后。,3、根据分离纯化工艺的要求来选择(accordingtorequirementofisolationanddepuration)分离纯化工艺应遵循以下原则:(1)工艺条件应温和,具有良好的稳定性和重复性:不受或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响,在任何环境下使用都应具有重复性,明确需严格控制的步骤和技术(2)尽可能减少组成工艺的步骤:步骤越多,产品的后处理收率越低,但必须保证产品的质量,(3)组成工艺的各技术或步骤之间要相互适应和协调(4)在工艺过程中要尽可能少用试剂,以免增加步骤,或干扰产品质量(5)时间要尽可能短,因稳定性差的产物随工艺时间增加,生物活性收率会降低,产品质量会下降(6)必须高效、收率高、易操作,对设备条件要求低,能耗低(7)具有较高的安全性:药品必须保证安全、无菌、无热原、无污染,第五节生物制品的质量控制(qualitycontrollingofbiopreparate)一、原材料的质量控制(qualitycontrollingofmateri
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