第5章微生物的遗传变异与菌种选育

第5章微生物的遗传变异与菌种选育,第一节微生物遗传变异的物质基础第二节微生物的基因突变第三节微生物的基因重组第四节微生物的菌种选育第五节微生物菌种保藏及复壮,第二节微生物的基因突变,突变:指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变率常在10-910-6范围内。从突变涉及的范围，突变分为：基因突变染色体畸变,(一)基因突变的类型（根据遗传信息的变化）,原序列5-AUGCCUUCAAGAUGUGGGMetProSerArgCysGly同义突变5-AUGCCUUCAAGAUGUGGAMetProSerArgCysGly错义突变5-AUGCCUUCAGGAUGUGGAMetProSerGlyCysGly,(一)基因突变的类型（根据遗传信息的变化）,原序列5-AUGCCUUCAAGAUGUGGGMetProSerArgCysGly无义突变5-AUGCCUUCAAGAUGAGGAMetProSerArg移码突变5-AUGCCUUCAAGUGUGGGMetProSerSerVal,无义突变:由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子UAA、UAG或UGA，从而使肽链合成提前终止。移码突变：在正常地DNA分子中,碱基缺失或增加非3的倍数,造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变，这种现象称移码突变。,染色体畸变,DNA的大损伤染色体畸变，包括以下两个方面：染色体结构上的缺失、重复、易位和倒位染色体数目的变化。,易位：断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。倒位：断裂下来的DNA片段旋转180后，重新插入到原来染色体的位置上；,染色体结构上的变化,染色体内畸变只涉及一条染色体上的变化如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加；如发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。染色体间畸变，则指非同源染色体间的易位。,突变的表型突变株的表型成因检出方法营养缺陷型因突变而丧失合成一补充培养基（auxotroph）种或几种生长因子的能力，不能在基本培养基上生长抗性突变型因突变而产生了对某药物培养基（resistantmutant）种化学药物或致死物理因子的抗性条件致死突变型突变后在某种条件下培养条件改变（conditional可正常生长、繁殖并lethalmutant）实现其表型，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型,突变株的表型成因检出方法形态突变型因突变而产生的个体形态Morphologycal或菌落形态改变（常用颜色变化抗原突变型因突变而引起的细胞借助于抗原antigenic成分发生改变抗体反应产量突变型因突变而获得的在有测定产量或highproducing用代谢物产量上高于其它mutant原始菌株的突变株,一些菌种某些性状的自发突变率,突变的机制,碱基置换（转换颠换）基因突变移码突变（缺失添加）诱变染色体畸变：缺失、添加、易位、倒位自发突变,突变,突变的原因：自发、诱发,自发突变：没有人工参与的情况下微生物自然发生的突变诱发突变：物理（紫外线、射线、激光、等离子）或化学因素（烷化剂、吖啶类化合物等）导致,基因突变的特点1.不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。2.自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。3.稀有性：突变率低且稳定。4.独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。5.可诱发性：诱变剂可提高突变率。6.稳定性：变异性状稳定可遗传。7.可逆性：原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变，相反的过程则称为回复突变或回变。,基因突变的机制,自发突变机制1、背景辐射和环境因素的影响：由于一些原因不详的低剂量诱变因素的长期总和诱变效应。如各种短波辐射或高温，以及自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变物质的作用等。2、微生物自身有害代谢产物的诱变效应：如咖啡碱、硫氰化合物等。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株。,3、氨基的互变异构效应：T和G会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现，而C和A则会以亚氨基式或氨基式两种互变异构的状态出现。4、环状突变效应：在DNA的复制过程中，某一单链上偶然产生一个小环，其上的基因就会越过复制而发生遗传缺失。,碱基置换（转换颠换）点突变移码突变（缺失添加）诱发突变染色体畸变：缺失、添加、易位、倒位,诱发突变的机制,碱基置换移码突变染色体畸变,1、碱基置换定义：对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤,一般也称点突变。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。分类：转换:DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤,或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换.颠换:DNA链中的一个嘌呤被另一个嘧啶,或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。,直接引起置换的诱变剂,如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。它们可与碱基发生化学反应。,碱基转换的分子机制,亚硝酸可使碱基发生氧化脱氨作用，故它能使腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤（H），使胞嘧啶（C）变成尿嘧啶（U），从而发生转换。,间接引起置换的诱变剂,引起这类变异的诱变剂都是一些碱基类似物，如5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、2-氨基嘌呤和6-氯嘌呤等。它们的作用是通过细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后而引起碱基置换.,2、移码突变：DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤。有效诱变剂：吖啶类染料，如吖啶黄、吖啶橙和-氨基吖啶等。,吖啶类化合物的诱变机制,至今还不很清楚。有人认为，它们能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。,第三节微生物的基因重组,基因重组：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。重组是分子水平上的一个概念，而一般所说的杂交则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。,基因重组的意义,基因重组是杂交育种的理论基础。杂交育种的优点：选用已知性状的供体菌和受体菌作为亲本利用杂交育种可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象,一、原核微生物的基因重组,转化转导接合,基因重组的方式,转化,转化或转化作用：受体菌直接吸收来自供体菌的DNA片段，通过交换整合到自己的基因组中，从而获得部分新的遗传型状的现象。接受了供体菌DNA的受体菌称为转化子范围：原核生物中，转化是一个较普遍的现象。若干放线菌和蓝细菌及少数真核微生物也有转化报道。,转化发生的条件两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。但即使在转化率极高的那些种中，其不同菌株间也不一定都可发生转化。进行转化的受体细胞必须处于感受态，亦即受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。也可以采用人工的方法使细菌转变成感受态,转导,转导：以噬菌体为媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传形状的现象。获得新遗传形状的受体细胞称为转导子。转导的方式：普遍转导转导特异性转导,普遍转导：噬菌体能传递供体菌任何基因。转导频率：10-810-5,特异性转导：噬菌体只能传递供体菌某些特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）转导频率：10-6,接合,概念：供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状。存在范围：细菌和放线菌中都存在接合现象。,二、真核微生物的基因重组,真核微生物的基因重组的方式有性杂交准性生殖,有性杂交：性细胞接合，质配、核配，减数分裂，染色体重组，并产生新遗传型后代。,有性杂交育种,过程：将甲亲本与乙亲本菌株分别接种到产孢子培养基斜面上，用蒸馏水洗下子囊，机械法破坏子囊获得子囊孢子，将子囊孢子铺平板获得单倍体细胞组成的菌落，通过离心等方法使单倍体细胞密集接触，即有机会产生双倍体的有性杂交后代。,准性生殖：同种微生物的两个不同来源的体细胞发生融合，以有丝分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。,工业生产常用的微生物*从自然界中分离出来就能被利用；对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。使用重组DNA技术改造的菌株育种的目的：改善菌种的特性，使之能提高产量、改进质量、降低成本、改进工艺、方便管理及综合利用等。目前育种总趋势从野生菌转向变异菌自然选育转向代谢育种从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。,工业生产中微生物育种的基本方法包括：自然选育、诱变育种、杂交育种及基因重组定向育种等。,第四节微生物的菌种选育,一、自然选育采样增殖培养从自然界选育菌株纯种分离性能鉴定从自发突变中选育菌株,诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对象DNA的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其它微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。,诱变育种,选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验,1、出发菌株的选择,出发菌株用来育种处理的起始菌株出发菌株应具备对诱变剂的敏感性高、变异幅度广具有特定生产性状的能力或潜力出发菌株的来源自然界直接分离到的野生型菌株长期在生产条件下驯化而筛选菌株,2、同步培养：对数生长期：生长状态比较同步，容易变异3、制备单细胞或单孢子悬液要求菌体处于对数生长期，细胞分散且为单细胞，方法：玻璃珠打散10-15min;用无菌脱脂棉过滤。制备：物理诱变剂生理盐水化学诱变剂缓冲液浓度：细菌、放线菌108个/ml霉菌、酵母菌106个/ml,4、诱变处理诱变剂剂量的选择用5085%的杀菌剂量诱变剂使用方式单一处理复合处理,5、中间培养：诱变处理后再液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖3代以上，得到纯的变异细胞。6、分离、筛选筛选方案：分为初筛和复筛两步进行。初筛：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网。复筛：对突变株的生产性能作比较精确的定量测定。一般是将微生物摇瓶培养，然后再对培养液进行分析测定，确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,原生质体育种,原生质体：脱去细胞壁的细胞。原生质体育种：通过人工方法将遗传性状不同的两个细胞的细胞壁去除，采用理化或生物学方法诱导它们的原生质体发生融合而产生重组子的过程。过程：原生质体的制备、原生质体的融合（使遗传物质重新组合）、细胞壁的再生、筛选优良性状的融合子、实用型菌株的筛选。,基因工程技术用于工业菌种改良,基因工程：用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质-DNA提取出来，在离体的条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中使供体DNA进行正常的复制和表达，从而获得新物种。,DNA重组改良菌种,1、目标DNA的获得：从微生物细胞中采集分离由mRNA反转录cDNA用化学方法合成特定功能的基因从基因库（美国、欧洲和日本等国家的生物技术信息研究中心保存的DNA序列数据库）中筛选、扩增获得2、选择载体：细菌质粒和噬菌体3、目标DNA与载体DNA的体外重组4、重组DNA引入宿主细胞,第5节微生物菌种保藏及复壮,衰退与复壮的概念衰退（degeneration）：在微生物的生长过程中，由于变异的存在，使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退。复壮(rejuvenation)：狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种,第5节微生物菌种保藏及复壮,微生物工业对菌种的要求(1)廉价原料、生长迅速、目的产物产量高。(2)易于控制培养条件，酶活性高；发酵周期较短。(3)抗杂菌和嗜菌体的能力强。(4)菌种纯，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。,菌种保藏,基本原理：根据菌种的生理、生化特点，人为地创造条件，使菌种的代谢活动处于休眠状态。要求：维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来优良的生产性能。挑选典型菌种的优良纯种一般采用微生物的休眠体（如孢子、芽孢等）创造适于微生物长时期休眠的环境条件（如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸碱中和剂等）,保存方法：应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同时也要考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保存方法，以便长期保藏。酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封保藏法。霉菌：斜面保藏法和沙土管保藏法。细菌：采用冷冻干燥保藏法。放线菌：沙土或冷冻保藏法。,菌种保藏的方法,菌连续在培养基上（内）移种种生活态传代培养保藏法连续在活宿主上（内）移种保固体斜面藏湿法半固体琼脂柱方休眠态液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管内吸附在合适的载体上(河沙、土壤、硅胶、滤纸、麸皮),干法保藏菌种的方法,滴入小试管（在放入