第四章-生物信息的传递(下)-翻译

第四章生物信息的传递（下）-从mRNA到蛋白质(Translation),4.1遗传密码-三联子4.2tRNA4.3核糖体4.4蛋白质合成的生物学机制4.5蛋白质转运机制,(1)翻译的起始核糖体与mRNA结合并与氨酰-tRNA生成起始复合物。,蛋白质的生物合成步骤：,(2)肽链的延伸由于核糖体沿mRNA5端向3端移动，开始了从N端向C端的多肽合成，这是蛋白质合成过程中速度最快的阶段。,(3)肽链的终止及释放核糖体从mRNA上解离，准备新一轮合成反应。,核糖体是蛋白质合成的场所。mRNA是蛋白质合成的模板。转移RNA(transferRNA，tRNA)是模板与氨基酸之间的接合体。在合成的各个阶段有许多蛋白质、酶和其他生物大分子参与。,翻译：是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。,4.1遗传密码-三联子,4.1.1三联子密码及其破译4.1.2遗传密码字典4.1.3遗传密码的性质,4.1.1三联子密码及其破译,1.两个基本概念遗传密码(geneticcode):DNA（或mRNA）中核苷酸序列与蛋白质中氨基酸序列之间的对应关系。密码子(codon)：mRNA上每3个相邻核苷酸编码多肽链中一个氨基酸，这三个核苷酸称一个密码子或三联体密码。,2.遗传密码破译简史,（1）1954年Gamow首先对遗传密码进行了探讨；（2）1961年Crick证明三联体密码子是正确的；（3）1961年，Nirenberg以均聚物、随机共聚物、特定序列的共聚物作模板合成多肽，破译遗传密码；（4）1964年Nirenberg用核糖体结合技术研究遗传密码，直接测出三联体对应的氨基酸；（5）到1966年，遗传密码全部破译。,核糖体结合技术,保温,硝酸纤维滤膜过滤,分析留在滤膜上的核糖体-AA-tRNA,确定与核糖体结合的AA和模板,特定三核苷酸为模板+核糖体+20种AA-tRNA(其中一种AA-tRNA的氨基酸被14C标记）,半胱氨酸,4.1.2遗传密码字典,4.1.3遗传密码的性质,1.密码的连续性2.密码的简并性与兼职性3.密码的通用性与特殊性4.密码子与反密码子识别的摆动性,1.密码的连续性,在mRNA翻译过程中，mRNA的编码方向是53，肽链从N端向C端延伸。一条肽链合成起始后，密码子按3个一框读下去不重叠也不跳格，直到碰到终止密码子。,2.密码的简并性与兼职性,简并性：许多氨基酸对应的密码子不止一种。兼职性：AUG（Met)和GUG（Val)两个密码子除代表特定氨基酸外，还兼作起始密码子。,Aminoacidshave1-6codonseach,除色氨酸和甲硫氨酸只有一个密码子外，其它18种氨基酸都有一个以上的密码子。,同义密码子：对应同一个氨基酸的密码子称为同义密码子。密码子的种类与相应氨基酸在蛋白质中的频率有一定的相关性。只有精氨酸例外。,3.密码的通用性与特殊性,通用性：遗传密码无论在体内还是体外，无论是对病毒、细菌、动物还是植物而言都通用；特殊性：遗传密码的个例很少见；基因组中编码含义的改变常涉及到对终止密码子的解读；密码子系统性改变只存在于线粒体中。,4.密码子与反密码子的相互作用(摇摆假说),在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，而第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”。,1）mRNA上密码子第一、二碱基与tRNA上反密码子相应碱基形成强配对；密码专一性主要是由于这两个碱基的作用；,2）反密码子的第一个碱基决定一个tRNA能够解读密码子的数目；,3）当一种氨基酸的几个密码子中，有头2个碱基中任一个是不同的，则必须有不同的tRNA。原核生物中大约有3045种tRNA，真核细胞中可能存在50种tRNA。,终止密码子（terminationcodon）：UAA、UAG、UGA；终止密码子不编码任何氨基酸，也称为无义密码子（nonsensecodon）。,4.2tRNA,4.2.0引言4.2.1tRNA的基本结构4.2.2tRNA的功能4.2.3tRNA的种类,mRNA：蛋白质的DNA序列信息的中间体。tRNA：运送特定氨基酸到核糖体上合成蛋白质。rRNA：核糖体的组成元件。,4.2.0引言,4.2.1tRNA的基本结构,tRNA二级结构,tRNA三级结构,tRNA上的手臂：（1）受体臂：链两端碱基序列互补形成的杆状结构；3端有未配对的34个碱基；3端的CCA，最后一个碱基2自由羟基可被氨酰化。（2）TC臂（环）其中表示拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有的不常见核苷酸。（3）反密码臂（环）位于套索中央有三联反密码子。（4）D臂（环）含有二氢尿嘧啶。（5）多余臂（环）,5,一般tRNA有76个碱基，大小在7495bp之间，主要由于D臂和多余臂的变化引起。,tRNA序列包含许多稀有碱基，主要通过四种标准碱基修饰而来。,tRNA折叠为L形，与氨基酸结合的受体臂与反密码环相互远离，分别位于两端；不同的tRNA形状大体相同又有所差异。,tRNA三级结构,tRNA特异性只取决于反密码子,与携带的氨基酸无关,4.2.2tRNA的功能,tRNAisanadaptor,1、解读mRNA的遗传信息2、运输的工具，运载氨基酸,tRNA有两个关键部位：3端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。与mRNA结合部位反密码子部位,tRNA凭借自身的反密码子与mRNA链上的密码子相识别，把所带氨基酸放到肽链的一定位置。,tRNA在识别mRNA分子上的密码时具有接头作用。,1、起始tRNA和延伸tRNA能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA称起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。真核生物：起始密码子AUG所编码的氨基酸是Met，起始AA-tRNA为Met-tRNAMet。原核生物：起始密码子AUG所编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身,而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA为fMet-tRNAfMet。,4.2.3tRNA的种类,2、同工tRNA代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA。同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被相同的氨酰-tRNA合成酶识别。,3.校正tRNA：通过tRNA中反密码子改变来校正密码子突变，使其在突变位点引入正确氨基酸。无义突变(nonsensemutation):指DNA上任何代表氨基酸的密码子变为终止密码子的改变。错义突变(missensemutation):指DNA分子中核苷酸置换后改变了mRNA上遗传密码，导致合成的多肽链中一个氨基酸被另一氨基酸所取代的改变。,无义突变,校正tRNA通过改变反密码子区校正无义突变,错义抑制,氨酰-tRNA合成酶,AA-tRNA合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶。反应式如下：AA+tRNA+ATPAA-tRNA+AMP+PPi包括两步反应（1）氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。AA+ATP+酶（E）E-AA-AMP+PPi（2）氨酰基转移到tRNA3末端腺苷残基的2或3-羟基上。E-AA-AMP+tRNAAA-tRNA+E+AMP,蛋白质合成的真实性主要决定于tRNA能否把正确的氨基酸放到新生多肽链的正确位置上，而这一步主要决定于AAtRNA合成酶是否使氨基酸与对应的tRNA相结合。AA-tRNA合成酶既要能识别tRNA，又要能识别氨基酸，它对两者都具有高度的专一性。,4.3核糖体,4.3.0引言4.3.1核糖体的结构4.3.3核糖体的功能,生物细胞内，核糖体像一个能沿mRNA模板移动的工厂，执行着蛋白质合成的功能。,4.3.0引言,核糖体是由几十种蛋白质和多种核糖体RNA（rRNA）所组成的亚细胞颗粒。一个细菌细胞内约有20000个核糖体，而真核细胞内可达106个。这些颗粒既可以游离状态存在于细胞内，也可与内质网结合。,8,真、原核生物中均由大、小两个亚基组成，二亚基各含一个主要RNA，称为核糖体RNA（ribosomalRNA，rRNA）和多种蛋白质。,1、核糖体由大小两个亚基组成,4.3.1核糖体的结构,RibosomesarelargeribonucleoproteinparticlesthatcontainmoreRNAthanproteinanddissociateintolargeandsmallsubunits.,大亚基和小亚基的三维结构,关于细胞器核糖体,与胞质中的存在明显差异，并具不同形式。有时与细菌核糖体大小相当（70%rRNA），有时仅60S（30%rRNA）核糖体存在于每个进行蛋白质合成的细胞中。虽然在不同生物内其大小有别，但组织结构基本相同，而且执行的功能也完全相同。,多核糖体（polysome）电镜照片,原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成。真核生物核糖体中RNA占3/5，蛋白质占2/5。,2、核糖体蛋白(ribosomalprotein,r-蛋白）核糖体上有多个活性中心，每个中心都由一组特殊的核糖体蛋白质构成。核糖体是一个许多酶的集合体，单个酶或蛋白只有在这个总体结构内才拥有催化性质，它们在这一结构中共同承担了蛋白质生物合成的任务。大肠杆菌核糖体小亚基由21种蛋白质组成；大亚基由36种蛋白质组成。真核细胞核糖体大亚基含有49种蛋白质；小亚基有33种蛋白质。,（1）5SrRNA细菌5SrRNA含有120个核苷酸（革兰氏阴性菌）或116个核苷酸（革兰氏阳性菌），位于50S大亚基内。两个高度保守的区域：一个区域含有保守序列CGAAC，是5SrRNA与tRNA相互识别的序列。另一个区域含有保守序列GCGCCGAAUGGUAGU，是5SrRNA与50S核糖体大亚基相互作用的位点。,3、核糖体RNA,（2）16SrRNA在蛋白质合成中起着积极的作用。它与mRNA、50S亚基和P位和A位的tRNA的反密码子直接作用。长约14751544个核苷酸之间，含有少量修饰碱基，位于30S小亚基内。16SrRNA的结构十分保守：3端一段ACCUCCUUA的保守序列，与mRNA5端翻译起始区中富含嘌呤（SD）序列互补。在靠16SrRNA3端处还有一段与23SrRNA互补的序列，在30S与50S亚基的结合中起作用。,（3）23SrRNA（位于50S大亚基内）。含与tRNA及5SrRNA互补序列。（4）5.8SrRNA是真核生物核糖体大亚基特有的rRNA，长度为160个核苷酸，含有修饰碱基。还含有与原核生物5SrRNA中的保守序列CGAAC相同的序列，可能是与tRNA作用的识别序列。说明5.8SrRNA可能与原核生物5SrRNA有相似的功能。,（5）18SrRNA酵母18SrRNA由1789个核苷酸组成，它的3端与大肠杆菌16SrRNA有广泛的同源性。其中酵母18SrRNA、大肠杆菌16SrRNA和人线粒体12SrRNA在3端有50个核苷酸序列相同。（6）28SrRNA长度约在38904500bp左右。,16SrRNA3端与mRNA直接相互作用；5SrRNA与tRNATC环上GTCG序列作用；16SrRNA直接与A、P位点的tRNA反密码子作用；23SrRNA则与A、P位点的肽酰-tRNA的CCA末端作用；16S、23S均参与亚基间的相互作用。,rRNA与tRNA、mRNA之间以及rRNA之间存在的联系,4、核糖体有3个tRNA结合位点,核糖体有3个tRNA结合位点。A位：新到来的氨酰-tRNA的结合位点；P位：肽酰-tRNA的结合位点；E位：延伸过程中的多肽链转移到氨酰-tRNA上释放tRNA的位点。tRNA的移动顺序：A位P位E位。每个tRNA结合位点横跨核糖体的大、小亚基。,4.3.2核糖体的功能,mRNA结合部位；结合AA-tRNA部位（A位）；结合肽基tRNA部位和起始AA-tRNA（P位）；空载tRNA移出部位（E位）；形成肽键的部位。此外，还有用于起始和延伸的各种蛋白质因子结合部位。,核糖体发挥生物学功能的5个基本部位,大小亚基的生物学功能,小亚基：负责对模板mRNA进行序列特异性识别，如起始部分的识别、密码子与反密码子的相互作用等，mRNA的结合位点也在小亚基上。大亚基：负责携带AA及tRNA的功能，包括肽键的形成、AA-tRNA与肽酰-tRNA的结合等。,4.4蛋白质合成的生物学机制,4.4.1氨基酸的活化4.4.2翻译的起始4.4.3肽链的延伸4.4.4肽链的终止4.4.5蛋白质前体的加工4.4.6蛋白质的折叠4.4.7蛋白质合成的抑制剂,4.4.1氨基酸的活化,1.氨基酸的种类2.氨基酸的活化机制3.氨基酸活化引入的错误,Ala（A）Val（V）Leu（L）Ile（I）Pro（P）Met（M）His（H）Gly（G）Ser（S）Thr（T）Cys（C）Phe（F）Trp（W）Asp（D）Glu（E）Lys（K）Gln（Q）Arg（R）Tyr（Y）Asn（N）,1.氨基酸的种类,2.氨基酸的活化机制,总反应：aminoacyl-tRNAsynthetaseAA+tRNA+ATPAA-tRNA+AMP+PPi实际反应：第一步：AA+ATP+EE-AA-AMP+PPi第二步：E-AA-AMP+tRNAAA-tRNA+E+AMPAA:aminoacid;AA-tRNA:aminoacyl-tRNAE:aminoacyl-tRNAsynthetase,3.氨基酸活化引入的错误,氨酰-tRNA合成酶可将tRNA和氨基酸进行分类：每一种氨酰-tRNA合成酶识别一种氨基酸和所有能装载该氨基酸的tRNA。蛋白质合成真实性主要决定于：tRNA能否把正确的氨基酸放到新生多肽链的正确位置。氨酰-tRNA合成酶会引入两种错误：一种是将错误氨基酸加在正确tRNA上；另一种是将正确氨基酸加在错误tRNA上。前者现错可能性更大。,氨基酰-tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都有高度特异性。氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性(proofreadingactivity)。氨基酰-tRNA的表示方法：Ala-tRNAAlaSer-tRNASerMet-tRNAMet,tRNA与酶结合的模型,tRNA,氨酰-tRNA合成酶,ATP,原核生物中，起始氨基酸是：起始AA-tRNA是：真核生物中，起始氨基酸是：起始AA-tRNA是：,甲酰甲硫氨酸fMet-tRNAfMet甲硫氨酸Met-tRNAiMet,4.4.2翻译的起始,4.4.2.1原核生物蛋白质合成起始4.4.2.2真核生物蛋白质合成起始4.4.2.3原核和真核生物蛋白质合成起始比较,原核生物（细菌）为例：所需成分：30S小亚基、50S大亚基、模板mRNA、fMet-tRNAfMet、GTP、Mg2+翻译起始因子：IF-1、IF-2、IF-3,一般，特定的mRNA的翻译效率受起始速度所决定。,4.4.2.1原核生物蛋白质合成起始,IF-3,IF-1,翻译起始(翻译起始复合物形成)又可被分成几步：1.核糖体大小亚基分离,2、30S小亚基通过SD序列与mRNA模板相结合。,IF-3,IF-1,S-D序列,IF-3,IF-1,3.在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,4、带有tRNA、mRNA和3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。,原核生物蛋白质合成总结,细菌三种重要起始因子IF-3：稳定30S亚基；辅助30S亚基与mRNA上起始点特异性结合；IF-1：与30S亚基结合在A位，阻止氨酰-tRNA进入；阻止30S与50S亚基结合。IF-2：结合特定起始因子tRNA，控制它进入核糖体；有核糖体依赖GTP酶活性；,Initiationrequiresfactorsandfreesubunits,核糖体较大,为；起始因子比较多；mRNA5端具有m7Gppp帽子结构Met-tRNAMetmRNA的5端帽子结构和3端polyA都参与形成翻译起始复合物；,4.4.2.2真核生物蛋白质合成起始,真核生物翻译起始复合物的形成,真核生物翻译起始复合物形成过程,原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合。而在真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模板mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始复合物。,4.4.2.3原核和真核生物蛋白质合成起始比较,4.4.2.3原核和真核生物蛋白质合成起始比较,肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括：AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位。延伸因子(elongationfactor,EF)：原核生物：EF-T(EF-Tu,EF-Ts)、EF-G真核生物：EF-1、EF-2,4.3.3肽链的延伸,1、AA-tRNA与核糖体A位点的结合,需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts两种延伸因子,通过延伸因子EF-Ts再生GTP,形成EF-TuGTP复合物,EF-Tu-GDP+EF-TsEF-Tu-Ts+GDPEF-Tu-Ts+GTPEF-Tu-GTP+EF-Ts,重新参与下一轮循环,2、肽键形成是由转肽酶/肽基转移酶催化,延长因子EF-G有转位酶(translocase)活性，可结合并水解1分子GTP，促进核蛋白体向mRNA的3侧移动。,3、移位：核糖体向mRNA3端方向移动一个密码子。P位上的tRNA脱落。核糖体沿mRNA模板（53）移动的同时，原处于A位带有肽链的tRNA被动转到P位。需要消耗GTP，并需EF-G延伸因子。,fMet,fMet,4.4.4肽链的终止,1.三种终止密码子2.释放因子3.肽链合成终止反应过程,1.三种终止密码子,三个终止密码子（terminationcodon，stopcodon)UAA、UAG和UGA终止蛋白质合成；UAA是最常用的终止密码子。UGA比UAG使用频率高一点，但UGA出错可能性更大。,2.释放因子,终止密码子是被蛋白质释放因子(releasefactor，RF)而不被氨酰-tRNA所识别.,（1）原核生物的RF,I型释放因子结构类似于氨酰-tRNA*EF-Tu和EF-G；I型释放因子（RF1识别UAA和UAG，RF2识别UGA和UAA），它们在A位发挥作用（此时P位要有肽酰-tRNA），并水解肽酰-tRNA上的键；释放因子约占核糖体的1/10II型释放因子(RF3)依赖GTP发挥作用，它协助I型因子；,真核生物I型释放因子eRF1是一个识别全部三种终止密码子的单体蛋白质，其序列与细菌的释放因子有同源性。但eRF3是一种在酵母体内翻译中必需的释放因子。,（2）真核生物的RF,GTP在蛋白质合成中的作用,GTP是一种变构因子，可通过结合诱使大分子形状发生变化使翻译准确ppGpp，pppGpp“严格控制”反应的多效应的信号分子“严格控制”系统在原核生物中具有普遍性,3.肽链合成终止反应过程,4.4.5蛋白质前体的加工,1.N端fMet或Met切除2.二硫键形成3.特定氨基酸的修饰4.切除新生肽链中的非功能片段,1.N端fMet或Met切除,不管原核生物或真核生物，N端Met常在肽链合成完前被切除。细菌蛋白质N端甲酰基能被脱甲酰化酶水解。有些病毒mRNA可翻译成很长多肽链，经蛋白酶水解后得到几个功能蛋白质分子。,图4-20新生蛋白质经蛋白酶切割后变成有功能的成熟蛋白质,两个半胱氨酸-SH二硫键mRNA中没有胱氨酸密码子，而不少蛋白质都含有二硫键。蛋白质合成后往往通过两个半胱氨酸的氧化作用生成胱氨酸。,氧化,2.二硫键形成,3.特定氨基酸的修饰,氨基酸侧链修饰作用包括磷酸化(如核糖体蛋白质)、糖基化(如各种糖蛋白)、甲基化(如组蛋白、肌肉蛋白质)、乙基化(如组蛋白)、羟基化(如胶原蛋白)和羧基化等。图4-23显示了生物体内最常见的被修饰的氨基酸及其修饰产物。,4.切除新生肽链中的非功能片段,不少多肽类激素和酶的前体需要经过加工才能变为活性分子，如胰蛋白酶原经过加工切去部分肽段才能成为有活性的胰蛋白酶。,图4-25前胰岛素原蛋白翻译后成熟过程示意图,蜂毒蛋白只有经蛋白酶水解切除N-端的22个氨基酸以后才有生物活性。该胞外蛋白酶只能特异性切割X-Y2肽，其中X是丙氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸，Y是丙氨酸或脯氨酸。,4.4.6蛋白质的折叠,新生肽链必须通过正确折叠才能成为动力学和热力学稳定的三维构象,从而表现出相应生物学活性。有些蛋白质只有在其他蛋白质（如分子伴侣）帮助下才能正确折叠。分子伴侣（Chaperon)可以帮助新生蛋白质正确折叠，同时还可帮助纠正错误折叠或介导其降解。,细胞内至少有二类分子伴侣家族,热休克蛋白：包括HSP70、HSP40、GrpE三个家族，广泛存在于原核及真核细胞中。三者协同作用，促使某些自发折叠的蛋白质正确折叠。伴侣素：包括HSP60、HSP10，主要为非自发折叠蛋白提供能折叠形成天然结构的微环境。分子伴侣在新生肽链折叠中主要通过防止或消除肽链的错误折叠，增加功能性蛋白质折叠产率来发挥作用。,4.4.7蛋白质后成的抑制剂,蛋白质生物合成的抑制剂主要是一些抗生素。如嘌呤霉素、链霉素、四环素、氯霉素、红霉素等抗生素对蛋白质合成的抑制机制：（1）阻止mRNA与核糖体结合(氯霉素)；（2）阻止AA-tRNA与核糖体结合(四环素类)；（3）干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生错读(链霉素、新霉素、卡那霉毒等)；（4）作为竞争性抑制剂抑制蛋白质合成（嘌呤霉素）。,四环素族,注意：青霉素、四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用，阻遏原核生物蛋白质的合成，抑制细菌生长。氯霉素和嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合，又能与真核生物核糖体结合，妨碍细胞内蛋白合成，影响细胞生长。,4.5蛋白质转运机制,4.5.0概述4.5.1翻译-转运同步机制4.5.2翻译后转运机制4.5.3细菌蛋白质的易位4.5.4蛋白质的降解,4.5.0概述,细胞中蛋白质合成：绝大多数在细胞质中合成；一小部分在细胞器（叶绿体和线粒体）中合成。定位于细胞器内的大部分蛋白质在细胞质中合成，细胞器内合成的留在细胞器内。细胞中各种蛋白质合成和转运过程见图4-28，其中几类主要蛋白质的转运机制见表4-13。,若某个蛋白质的合成和运转是同时发生的，则属于翻译转运同步机制；若蛋白质从核糖体上释放后才发生运转，则属于翻译后转运机制。这两种运转方式都涉及到蛋白质分子内特定区域与细胞的膜结构的相互关系。,蛋白质的两种转运方式,信号肽假说信号肽：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端氨基酸序列（有时不一定在N端）。,4.5.1翻译-转运同步机制,信号肽的特点：,（1）一般带有10-15个疏水氨基酸；（2）在靠近该序列N-端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链