第四章-蛋白质的物理化学性质

第四章蛋白质的物理化学性质,在国际上首先提出蛋白质的变性理论（1929年提出，1931年发表论文）,吴宪,每一种蛋白质分子都有自己特有的氨基酸的组成和排列顺序，由这种氨基酸排列顺序决定它的特定的空间结构。,Anfinsen,-Anfinsen原理,蛋白质必需基团的化学修饰和活性丧失的定量关系公式和作图法，被称为“邹氏公式”和作图法。,邹承鲁,一、热力学函数与热力学平衡,内能：组成物体的所有分子的无规则运动的动能与分子间相互作用的势能之和。焓(enthalpy)：是一个系统的热力学参数。它描述的是体系的一个状态性质，它的改变量仅仅取决于系统的始态和终态，用符号H表示，即H=E+pV其中，E为系统内能，p为其压强，V则为体积。,第一节、热力学函数与蛋白质构象,熵（S）:是度量体系混乱度的热力学函数。从微观的角度来看，熵具有统计意义，它是体系微观状态数(或无序程度)的一种量度。熵值小的状态，对应于比较有秩序的状态，熵值大的状态，对应于比较无秩序的状态。,内能(E)和焓(H)是体系自身的性质，要认识它们，需凭借体系和环境间热量和功的交换从外界的变化来推断体系E和H的变化值。熵也是如此，体系在一定状态下有一定的值，当体系发生变化时要用可逆变化过程中的热温熵来衡量它的变化值。,热力学把宇宙中我们感兴趣的部分定义为系统，诸如一个生物反应器或一个细胞，而把其他部分叫做它的环境。系统是开放的还是封闭的、隔离的，取决于其是否可与环境交换物质和能量。因为活细胞吸收营养物质、释放代谢产物，并做功和放热。因此它们是开放系统。系统状态由一组状态函数来定义。这些状态函数包括内能、焓、熵.,这些状态函数可用来表示和解释这两个热力学定律，经典热力学就是建立在这两个定律的基础上的。热力学第一定律：能量既不能创生也不能消灭。用数学方式表达为：U=0，其含义是，在任何隔离系统中系统储藏的能量不变。热力学第二定律：自发过程向熵值（宇宙的总的混乱程度）增加的方向进行。用数学方式表达为：S0，其含义是，在任何隔离系统中，不违背第一定律的过程得以进行的最起码的条件是该系统的熵值增加。,热力学第一定律阐明了任何过程都是能量守恒的，也就是说系统产生的能量必须由它的环境吸收。第二定律阐明了过程的自发性取决于总的熵变，在这个重新划定的隔离系统中，系统有序程度的增加，必须由它的环境混乱程度的更多的增加来弥补。,而且，过程的自发性不能单独由所研究的系统的熵变来决定，因为即使在系统的熵减少（即S系统0的情况下），放热过程（即H系统0，也就是热量从系统放出）也可能自发进行。譬如，变性的蛋白质自发折叠成高度有序的天然构象（系统的熵减少，S系统0），就是一例。当然在这种情况下，宇宙的总熵还是增加的，因为环境的熵的增加足以抵消系统的熵的减少。那么用什么量来判断自发过程好呢？,吉布斯自由能(Gibbsfreeenergy，G):亦称吉布斯函数，它是定温定压下系统的状态函数。可以用公式表示为：G=H-TS其中，T为绝对温度；S为体系的熵。这个状态函数是由J.WillardGibbs于1878年提出的。系统自由能的减少等于系统在恒温、恒压可逆过程中所做的最大有用功（不包括位移功）。在不可逆过程中系统所做的功必然小于体系自由能的减少。,由于活细胞中的所有生物化学过程几乎都是在恒温、恒压条件下进行的，在研究微生物的能量代谢时自然会对自由能的变化G发生兴趣。,在恒温恒压条件下，各类化学反应能否自发进行，取决于自由能的变化G的值，但反应的G与变化的途径无关。当G0时，自发过程，被称为是放能的（exoergic）过程，它们可以用来做功；当G0时，反应已达到平衡，即其正向过程和逆向过程正好处于平衡；当G0时，非自发过程，被称为吸能的（endergonic）过程，必须注入自由能才能驱动此类过程。,在细胞中，能直接驱动吸能过程的自由能有两类供体：在细胞内流通的能量货币（以ATP为代表）和能化了的生物膜（以p为代表）。它们一般在代谢过程中形成，在代谢过程中使用，特别是它们作为细胞的组成成分，在细胞的代谢中再生和周转。我们把这两类特殊能量形式叫做代谢能。,注意：虽然酶对于加速反应非常重要，但它们并不改变反应的G，作为催化剂它们只能加快热力学平衡的达到，却不能使G0的反应进行。反应或过程的吉布斯自由能随温度等变化，其值可以推算。,二、热容量,热容量:指系统在某一过程中，温度升高（或降低）1所吸收（或放出）的热量。热容量的单位是J/K。系统的热容量与状态的转变过程有关，与它所包含的物质的质量成正比，不同过程的热容量不同。通常规定，系统吸收的热量为正值，而释放的热量为负值，故在系统吸收热量引起温度升高时，热容量为正值。量热实验，特别是近几十年发展起来的使用微分扫描量热仪的实验，使得在蛋白质的折叠或退折叠转变过程中，直接测定热容量的变化成为可能。,三、vantHoff焓,VantHoff规则：荷兰科学家范特霍夫(VantHoff，1901年诺贝尔奖获得者)提出,温度每升高10K,反应速度一般增加到原来的2-4倍，该规律被称作VantHoff规则。,VantHoff焓主要在两态转变模型的分析中做出了贡献。,四、蛋白质构象与热运动,构象:由于单键基本自由旋转以及键角有一定的柔性，一种具有相同结构和构型的分子在空间里可采取多种形态，分子所采取的特定形态称为构象。构象角:分子的三维结构由绕着双原子共价键的旋转来决定，围绕单键旋转的角度称为构象角,它决定了多肽链的一个结构。,热运动:是指蛋白质溶液中所有分子的不停运动，包括了分子相对于容器的运动和分子内部各部分之间的相对运动。热运动在溶液中和多肽链的各部分之间传播，主要是通过多肽链各部分之间和多肽链与溶液分子之间的相互作用来实现的。体系达到热力学平衡时，在空间的一定范围内和在时间的一定间隔内的平均热运动能量不再发生变化，蛋白质处于天然态。,五、热力学参数在分子水平上的解释,从分子的相互作用来理解蛋白质天然结构的稳定性。为了使蛋白质折叠起来，就需要通过多肽链各部分间相互作用所引起的内能的减少来抵消构象熵减少带来的自由能增加。,弱的相互作用力对蛋白质稳定性的作用可以用水的性质来理解。熵是水溶液中形成疏水基团间结合的主要热动力学驱动力。,稳定蛋白质三维结构的作用力：氢键、范德华力、疏水作用力和盐键（离子键）及共价二硫键。,1静电相互作用,蛋白质的折叠态与退折叠态的空间结构不同，在水溶液中，表现为同一个可电离基团附近环境的有效介电常数的变化，于是它们的pka值（酸度系数）也不同。静电相互作用对折叠稳定性潜在的重要性。,2范德华相互作用,范德华力（vanderWaalsinteraction），又称为分子间力在物质的聚集态中，分子间存在着一种较弱的吸引力，当两个不带电荷的原子非常靠近时，它们的电子云相互作用，核周围电子位置的随机变化可能产生一个瞬间电偶。该电偶能够诱导邻近的原子产生一个短暂的反向电偶。这两个电偶之间会产生微弱的引力,从而拉近两个原子核。这种微弱的吸引力即为范德华力。,范德华力有三种来源：取向力:取向力是分子的固有偶极同极相互排斥异极相互吸引，定向排列，产生分子间作用力。诱导力:诱导力是分子的固有偶极与诱导偶极间的作用力，它的大小与分子的极性和变形性等有关。色散力:色散力是分子的瞬时偶极间的作用力，它的大小与分子的变形性等因素有关。一般分子量愈大，分子内所含的电子数愈多，分子的变形性愈大，色散力亦愈大。范德华力包括吸引力和斥力。,3.氢键（HydrogenBonding）,在生物相中最常见的氢键是羟基（-OH）和氨基（-NH）之间，其稳定性递减次序大约是OHNXONHN-NHO，这种键可以发生在分子间、分子内或者二者的结合。,氢键对蛋白质天然结构的稳定作用只能来自于水-水氢键+链内氢键，和水-肽链氢键两种情况下的自由能之差。蛋白质中有许多种氢键。,氢键在蛋白折叠过程中的作用,杜克大学的化学家们通过改变蛋白质关键部位的单个原子，发现了相对作用力较弱的氢键在使线形蛋白折叠成能发挥生物活性的最稳定结构中有重要作用,4.疏水效应（hydrophobiceffect）,疏水效应:水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部。这一现象被称为疏水作用或疏水效应.蛋白质溶液系统的熵增加（熵变化S为正值）是疏水作用的主要动力。,疏水作用是疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。要使疏水氨基酸R基团排除水而埋在内部，至少需要两层二级结构。两种简单形式，-环（-loop）和-角（-corner）。,5.二硫键,二硫键又称S-S键是共价键。是2个SH基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子间的键。在生物化学的领域中，通常系指在肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键。为了确定蛋白质的一级结构，须在2-巯-乙醇、二硫苏糖类、巯基乙酸等的硫化合物与尿素等变性剂同时存在下将二硫键打开.二硫键对肽链的正确折叠不是必要的，但它对稳定折叠态结构作出贡献。RNA酶复性实验。,6.盐桥或离子键,盐桥或离子键又称盐键，它是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。盐键的形成既是静电相互作用的过程也是熵增的结果。,第二节突变、稳定性和折叠,一、体外突变技术概念:体外突变技术是用酶学方法和化学方法剪切或合成DNA，将突变导入到克隆化的基因中，再将改变的基因重新克隆到生物体中分析该基因的功能变化的一项技术。分类:随机突变定点突变3.应用:研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系。,4.具体事例：改进-抗胰蛋白酶提高重组干扰素的专一活性提高T4溶菌酶的热稳定性磷酸丙糖异构酶的结构改造提高其稳定性,二、突变与热稳定性,1.定点突变对蛋白质稳定性的影响氨基酸的插入和删除、寡聚化和脯氨酸取代这三因素可以稳定个别嗜热蛋白。2.导致热稳定性的因素堆积、寡聚化、氨基酸插入和删除、脯氨酸取代、螺旋含量、螺旋倾向、极性表面积、氢键和盐桥。3.突变试验增加蛋白质的亲盐性例如亲盐的苹果酸脱氢酶中的唯一的谷氨酸替换为精氨酸。,三、蛋白质折叠,1.蛋白质折叠研究的概况蛋白质折叠:蛋白质的一级结构并没有生物活性，结构决定功能，一维的线型氨基酸序列转化为具有特征三维结构的天然蛋白质才具有生物活性，这种自我组装的过程被称为蛋白质折叠。追踪蛋白质重折叠的全过程的实验方法：快速核磁共振，快速光谱技术（荧光，远紫外和近紫外圆二色）等。,蛋白质折叠技术的研究应当将蛋白质结构研究与折叠过程动力学研究相结合以促进对蛋白质折叠机理的认识。“新生肽的折叠”问题与中心法则,2蛋白质折叠机制,Anfinsen经典的“热力学假说”认为天然蛋白质多肽链采取的构象是在一定环境条件下热力学上最稳定的结果，采取天然构象的多肽链和它所处的一定环境条件整个系统的总自由能最低。蛋白质多肽链折叠的过程，也就是从众多可能的构象中寻找系统自由能最低的状态的过程。,Wolynes提出粗糙能量地形面的观点,即折叠是在一个折叠漏斗中进行的。蛋白质折叠的过程就象多溪流水从具有复杂地形结构的山坡流下一样，而不仅是一溪流水从一单个山谷中流下。折叠的能量漏斗模型形象地描绘了折叠过程的多路径性,图能量漏斗模型,目前对蛋白质折叠过程的2种假设,肽链中的局部肽段先形成一些构象单元即螺旋、折叠和转角等二级结构，然后再是二级结构的组合、排列形成蛋白质的三级结构。首先是肽链内部的疏水作用起作用，产生一个塌陷过程，然后经调整，形成不同层次的结构。不同的假设，都有一个所谓“熔球态”的中间状态。,熔球体：在折叠中，第一个可观测到的中间体是未折叠多肽卷折成局部有组织的球状态。分子伴侣与蛋白质折叠分子伴侣的功能(1)可调节性地阻碍多肽链集聚(2)具有折叠互补功能,即可使已形成的蛋白质集聚体重折叠和恢复其水溶性(3)可以促进折叠错误的蛋白质降解,3.蛋白质折叠研究的最新进展,来自巴西圣保罗州立大学，美国纽约州立石溪大学,以及中科院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室的研究人员在之前研究的基础上发现了扩散(diffusion)在蛋白折叠动力学方面的重要作用。扩散系数随着蛋白质天然状态折叠级数的增加而减小，这主要是由于构造空间约束的一种紧密状态的塌陷造成的。它改变折叠动力学的比率和动力学路径。这修改了经典的转换状态理论，也为进一步了解折叠机制，更加完善定量经典转换状态理论提供了重要依据。,4.蛋白质折叠研究意义及应用前景,蛋白质折叠研究意义(1)最终阐明遗传信息传递的全过程，完全建立了分子生物学的中心法则。（2）蛋白质折叠机制的阐明有助于揭示生命体内第二套遗传密码的理论意义.（3）更加完善定量经典转换状态理论。,应用前景,（1）对包涵体的复性会有重要帮助。（2）DNA重组和多肽合成技术的发展使我们能够按照自己的意愿设计较长的多肽链。（3）深入了解蛋白质折叠与错误折叠的关系对于这些疾病的致病机制的阐明以及治疗方法的寻找将大有帮助。（4）蛋白质折叠机制的阐明是我们对于蛋白质相互作用、配体与蛋白质的作用等结构与功能关系研究的基础。（5）提高蛋白质结构预测的可靠性。,第三节蛋白质折叠热力学与动力学,蛋白质折叠内容：（1）变性的蛋白质或多肽链的折叠（2）通过三联密码翻译成的氨基酸序列链(新生肽链)的折叠蛋白质折叠的研究方法（1）X-射线晶体衍射（2）同源模建方法（3）从蛋白质序列出发，直接预测蛋白质的结构？,一、蛋白质折叠的热力学研究,Anfinsen认为,蛋白质的折叠结构在一定条件下是热力学最稳定的,即通常的自由能极小的状态。根据热力学方法的特点,热力学只能解决某一变化的趋势问题,即变化的可能性问题,而不能解决变化的现实性问题。通过物理化学中学过的熵函数和吉布斯自由能,简要分析蛋白质折叠结构中所蕴涵的热力学基本原理。,蛋白质折叠研究的漏斗模型,1.熵效应,熵增加原理：在绝热条件下，体系发生不可逆过程时，其熵值增大；而体系发生可逆过程时，其熵值不变；不可能发生熵值减小的过程。疏水作用的主要动力来自于蛋白质溶液体系的熵增效应。例如,疏水作用是肌红蛋白支持其多肽链折叠的主要驱动力,这种疏水作用使水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基隐藏在分子的内部，其在稳定蛋白质的三维结构方面占有突出的地位。,2.吉布斯自由能变化,G总=H链+H溶剂-TS链-TS溶剂折叠态蛋白质与伸展态相比，是一种高度有序化的结构，因此S链是负数，则-TS链为正值。折叠态蛋白质中疏水侧链主要是通过范德华力彼此相互作用。对于典型的蛋白质来说，对折叠结构的稳定性做出单项最大贡献的是疏水残基引起的S溶剂。,3折叠/退折叠转变,蛋白质折叠归根结底取决于在某温度（T）下折叠态（F）和伸展态（U）之间的吉布斯（Gibbs）自由能差（G）：G=GFGU=HTS=（HFHU）T（SFSU）在伸展态中多肽主链及其侧链是与溶剂水（也称介质水或环境水）相互作用的，因此折叠时自由能变化（G）的任何测量必须考虑多肽链和溶剂两者对焓变化（H）和熵变化（S）的贡献：G总=H链H溶剂TS链TS溶剂.极性侧链H链是正值，而H溶剂是负值。对蛋白质的极性侧链来说，G总接近于零，对蛋白质折叠不作实质性的贡献。,几种蛋白质折叠的热力学数据,在不同蛋白质中总熵变化（S链+S溶剂）和总焓变化对折叠结构的稳定性所做的贡献的份额是不同的,折叠结构在生理条件下是自由能最低的构象，因此多肽链的折叠是自发过程。,4.量热法与折叠过程热力学,量热试验是近年来发展起来的一种微分扫描量热议，用它可以直接测定热容量的变化，还可以测定焓变、熵变。,二、蛋白质折叠的动理学研究,蛋白质折叠线性多肽链的一级结构最终形成具有三维结构特征并表现其生物学功能的天然蛋白质的复杂过程。蛋白质折叠的步骤,1折叠动理研究技术与方法,Levinthalpuzzle：假定每个氨基酸残基可能的构象状态数为j，一个有N+1个氨基酸残基，N个肽单位的完全去折叠蛋白质，其肽链可能获得的构象状态数为jN。例如j=8,一个有101个氨基酸残基的较小的蛋白质，其肽链的可能构象状态为8100（1089）。如果构象之间的转换速率为k，蛋白分子经历全部构象的平均时间为：=（Nk）-1jN例如：101个氨基酸残基的蛋白质经历全部构象的时间多于1066年。蛋白质的折叠不是一个随机过程，而是通过特定的动力学途径达到天然构象，即动力学上最容易达到的构象。,蛋白质天然构象的形成,蛋白质多肽链正确折叠原因某些因素在蛋白质折叠的动力学过程中起控制作用。如：I型人类胰岛素生长因子（IGF-I）枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)蛋白质折叠动力学控制的研究基础-热力学假说蛋白质构象的研究方法测定溶液中的蛋白质分子构象测定晶体蛋白质分子构象,测定蛋白质构象的各种方法,2.过渡态,模拟的折叠过程,过渡态理论是否适合于描述蛋白质分子的折叠退折叠过程？,3折叠中间态,（1）熔球态（moltenglobule）主要特征:天然态二级结构，但三级结构却不完整；它比天然态有较多的疏水区域暴露；当熔球态变性到伸展态时，温度跃迁消失。例如Goto等发现，在强酸导致肽链完全伸展时，可以得到-乳球蛋白（-Lactoglobulin）、细胞色素c（cytochromec）及去辅基肌红蛋白（apo-Mb）的熔球态。蛋