组织DNA提取原理和步骤-详细

,组织DNA提取,TissueDNAExtraction,实验目的学习从生物组织中提取DNA，为研究DNA的理化性质与结构功能打好基础。,上海交通大学医学院,提取DNA总的原则：,1保证核酸一级结构的完整性；2其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；3核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。,上海交通大学医学院,粉碎组织DNP裂解液裂解细胞膜、核膜DNP苯酚、氯仿DNA（RNA）RNA酶Protase苯酚、乙醇纯DNA紫外定量,原理：,上海交通大学医学院,各种组织细胞破碎方法,上海交通大学医学院,破裂细胞、释放核酸,上海交通大学医学院,DNA酚抽提法示意图,上海交通大学医学院,DNA鉴定(DNAidentification),浓度鉴定(concentration)纯度鉴定(purity)完整性鉴定(integrity),上海交通大学医学院,浓度鉴定(concentrationidentification),1）紫外分光光度法(ultravioletspectrophotometery)测定DNA在A260nm的光吸收值。A260稀释倍数50g/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。,(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA或RNA，20g/ml单链寡核苷酸）,上海交通大学医学院,各种碱基的紫外吸收光谱,上海交通大学医学院,2）荧光光度法荧光染料溴化乙锭（ethidiumbromide，EB），可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）,上海交通大学医学院,EB与DNA的结合,上海交通大学医学院,500l全血提取的基因组DNA电泳,动物组织提取基因组DNA,上海交通大学医学院,纯度鉴定(purityidentification),紫外分光光度法：在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收，纯的DNA，A260与A280之比应在1.80；低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留量。纯的RNAA260与A280之比应在2.0。A260/A280比值是纯度检测的重要指标。,上海交通大学医学院,完整性鉴定(integrityidentification),凝胶电泳法：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。,上海交通大学医学院,核酸的贮存DNA保存(storage),1）短期贮存：4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的pH与DNA贮存有关，pH为8时，可减少DNA脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。2）长期贮存：TE缓冲液中-70保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。,上海交通大学医学院,每克组织+ml裂解液组织匀浆器，匀浆取2.0ml匀浆，加等体积苯酚-氯仿，摇匀5min，2,500rpm10min取水相加等体积氯仿-异戊醇,摇匀5min,2,500rpm10min,方法：,上海交通大学医学院,取水相加5MNaCl至终浓度0.3MNaCl,加2.5倍体积冰无水乙醇，摇匀见白色沉淀,玻棒挑起DNA70%乙醇洗涤一次沉淀溶于1mlTE适当稀释紫外分光光度计测A260nm,A280nm,上海交通大学医学院,吸取DNA原液l，用ddH2O稀释至l，在紫外分光光度计上测定A260nm及A280nm，计算A260nm/A280nm比值及DNA浓度。一般以A260nm/280nm1.8为标准。A260nm/A280nm若1.6，提示有蛋白质或酚污染，应进一步纯化。,定量,上海交通大学医学院,DNA浓度（g/ml）=A260nm50稀释倍数1/光径*1OD值相当于50g/mldsDNA，40g/mlssDNA或RNA，2Og/ml寡核苷酸。,浓度计算,上海交通大学医学院,1.裂解液（Homogenizationbuffer）:10mmol/LpH8.0Tris-HCl1mmol/LEDTA0.1mol/LNaCl1%SDSEDTA:抑制DNA酶活性,试剂及其作用,上海交通大学医学院,SDS是离子型表面活性剂，主要功能：溶解细胞膜蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；与蛋白形成复合物,上海交通大学医学院,2.苯酚-氯仿(Phenol-Chloroform):苯酚：强蛋白变性剂氯仿：蛋白变性剂，与水不互溶，与苯酚互溶，可以带走残余的酚。,上海交通大学医学院,为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？,苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚，并调节至中性。,上海交通大学医学院,3.氯仿-异戊醇（Isoamyl-alcohol）：能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中泡沫的产生，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白质及下层有机溶剂相维持稳定。,上海交通大学医学院,4.冰无水乙醇（Absoluteethonal）和70%乙醇(70%Ethonal):无水乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失去水而易于聚合；可除去残余的氯仿。70%乙醇洗涤可去除残余的盐离子，盐离子的存在会使之不易溶解，并可抑制酶反应。,上海交通大学医学院,5.TE缓冲液（TEBuffer）：10mmol/LpH8.0Tris-HCl1mmol/LEDTA缓冲对Tris-HCl不存在金属离子的干扰作用EDTA能稳定DNA的活性。,上海交通大学医学院,6.20%SDS（十二烷基磺酸钠）：抑制Dnase活性,上海交通大学医学院,7.10mg/ml蛋白酶K(ProtaseK)：分解蛋白质，破坏细胞膜8.10mg/mlRNA酶(RNase)：分解RNA,上海交通大学医学院,9.5mol/LNaCl：减少DNA分子间的同性电荷相斥力，使DNA易于相反聚合而形成DNA钠盐沉淀。,上海交通大学医学院,DNA提取试验中常遇到的问题,基因组DNA收率较低或无基因组DNA样本材料太少细胞破裂不够充分，DNA释放不完全离心力偏小两相分离不完全,上海交通大学医学院,DNA降解的原因样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因组DNA盐浓度过高基因组DNA中乙醇未清除净基因组DNA中可能存在其他抑制因素提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因加入多糖，保护DNA长度,上海交通大学医学院,注意事项,1.处死动物取出所用脏器后应尽快放入液氮中,以免DNase引起DNA降解。在纯化过程中要加核酸酶抑制剂(eg.EDTA),以防DNA自身降解。2.组织要尽量研磨得细一点，颗粒太大细胞裂解不彻底，在随后过程中会导致D