天根DP117-无内毒素质粒大提试剂盒说明书

产品概述该工具包采用了高效、特异性地结合质粒DNA的独特硅模具吸附技术。特殊溶液P4和过滤器CS1一起使用，可以有效地摆脱内毒素、蛋白质杂志。整个提取过程只需要一个小时，很容易，很快。使用该工具包提取的质粒DNA可能适合于酶切、PCR、测序、连接、转基因、细胞转染等多种常规操作。建议使用每种细菌的液体：高辐射质粒为100毫升，产率一般约为500-1500g；低辐射质粒建议使用200ml，产率一般在200-600g左右。注意：使用此套件之前，请务必阅读此注意事项。1.溶液P1在使用前放入rnasa(添加工具包中提供的所有rnasa)，混合2-8 保存。2.第一次使用前，应根据试验瓶标签上的说明，在冲洗液PW中先添加无水乙醇。3.使用前，检查平衡液BL、溶液P2和P4是否有结晶或沉淀。如果有结晶或沉淀现象，可以在37 的水浴中加热几分钟，恢复净化。4.注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖上盖子。5.使用过滤器时，小心地将密封慢慢地从过滤器管中取出，防止过滤器因压力而松动。6.提取的质粒的数量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等有关。如果质粒是低辐射质粒或大于10kb的质粒，则需要增加细菌的使用量，按比例增加P1，P2，P4的数量。洗脱缓冲液最好在65-70水浴中预热，适当延长吸附及洗脱时间，提高萃取效率。7.实验前使用平衡液体BL处理吸附柱，可以最大限度地激活硅基质膜，提高产率。8.均衡液处理的支柱最好立即使用，长期放置会影响使用效果。质粒DNA浓度和纯度检测结果质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法测定浓度和纯度。OD260值1大约相当于50g/ml双链DNA。精制质粒DNA OD260/OD280通常为1.8-2.0左右，可直接应用于细胞转染或动物身体实验等DNA纯度很高的实验。操作步骤：1.柱平衡阶段：吸附柱CP6上2.5ml的平衡液BL，8000rpm(8228g)离心力2分钟，从收集管中倒废液，吸附柱再放入收集管中。(平衡液处理的柱子最好立即使用。)。2.100毫升(根据培养菌浓度选择适量，推荐低副本为200毫升)，将通宵培养的细菌液放入离心管，室温收集细菌液体8000rpm(8228g) 3min，尽可能去除。注：细菌液可以通过多次离心力将细菌沉淀物收集到离心管中，从而使细菌量充分分解，细菌液过多会导致热分解不足，从而降低质粒提取效率。3.尽可能去除上等额，用干净的吸水纸吸干瓶壁上的水滴，这样上等额就全部被吸收了。4.将8ml溶液P1(确认是否添加了RNaseA)插入残留细菌沉淀的离心管，使用吸管或涡旋振荡器完全分解悬浮细菌细胞沉淀。注意：让菌完全悬浮沉淀，如果有没有完全混合的菌，会影响降解效果，萃取量和纯度可能较低，低辐射质粒会增加细菌用量，同时按比例增加P1，P2，P4的量。5.在离心管中加入8ml溶液P2，立即向上翻转68次，在室温中放置5min。注意：要顺利混合基因组的DNA，以免受到污染。此时，细菌变得清澈而粘稠，如果不清澈，由于细菌过多而无法分解，需要减少体量。6.将8ml溶液P4放入离心管中，立即充分混合68次，直到溶液发生白色分散絮沉淀。然后在室温下放置10分钟左右。8000rpm(8228g)离心5-10分钟，将白色沉淀从管子底部掉下来(可以适当增加离心时间)，小心地将所有溶液倒入过滤器CS1(不倒很多沉淀，切断过滤器)，慢慢推推手柄过滤，过滤器收集在干净的50毫升管子里(自己)注：添加溶液P4后，应立即混合，以免发生局部沉淀。离心后，如果滤液CS1中有白色沉淀，也不影响过滤，如果菌体太多，建议将离心时间延长到20-30min。7.在滤液中添加0.3倍滤液体积的异丙醇(添加过多的异丙醇会导致RNA污染)，向上和向下混合到吸附柱CP6中(吸附柱放置在50ml收集管中)。注：过滤后滤液可能会丢失，根据损失，添加不同体积的异丙醇，吸附热CP6的最大体积为15ml，因此需要对热进行两次分割。8.室温8000rpm(8228g)离心力2分钟，回绕回收管的废液，将吸附热CP6放回回收管。注意：步骤7中获得的溶液通过柱两次，每次按上述条件工作。9.在吸附柱CP6上添加10毫升冲洗液PW(先确认是否添加了无水乙醇)，8000rpm(8228g)离心两分钟，扔掉回收管的废液，将吸附柱放回回收管。10.重复步骤9。11.在吸附柱CP6中添加3ml无水乙醇，8000rpm(8228g)离心2min，对废液进行浮选。12.目的将吸附热CP6放回回收管，以8，000rpm ( 8228g)离心5min去除吸附热中的剩余冲洗液。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续酶反应(酶、PCR等)实验。要从残留乙醇进行下游实验，建议在室温下放置吸附热CP6帽，以便在吸附残留时完全干燥残留冲洗液。13.将吸附热CP6放入干净的50毫升收集管，在吸附膜中间部分悬挂的水滴上再加1-2毫升洗脱液TB，在室温下放置2min，室温为8000rpm(8228g)，离心2分钟。将50ml离心管的洗脱液全部移至干净的1.5ml离心管，然后储存为-20c。注：为了提高质粒的回收效率，可以将结果溶液添加回吸附柱，重复步骤13。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响。使用水作为洗脱物时，如果pH值在7.5-8.0范围内，且pH值小于7.0，则洗脱效率可能会降低。洗脱缓冲液的量主要根据质粒的拷贝数和实验所需的浓度来确定。容出缓冲液体积超过1毫升，体积太小，影响回收效率。DNA产物应保存在-20 防止DNA分解。可选步骤： (如果需要更好浓度的质粒，您可以：）14.将1.42ml异丙醇和0.42ml 5M NaCl(客户所有)放入每1ml液中，搅拌均匀，在室温下保持5mi