RNA提取准备工作及注意事项

一、枪头和EP管的消毒和灭菌1.用去离子水配制的0.1%(1/1000)DEPC(高毒性物质)应小心地放在通风柜中，避光并密封储存在4下。DEPC水是用DEPC(二乙氧基碳酸酯)处理并在高温高压下灭菌的粟米纯水。未检测到核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶和蛋白酶。2.将枪头和极压管放入0.1% DEPC，以确保枪头和极压管充满0.1% DEP。3、避光，静置过夜(12-24小时)4.装有枪头和电刺激管的盒子不需要用DEPC浸泡。在将枪头或电生理管中的DEPC水基本去除并干燥后，将其包装并包裹起来。5，121摄氏度，30分钟6，180摄氏度，干燥数小时(至少3小时)。注意：处理DEPC时应该戴乳胶手套和口罩！乙、或不DEPC消毒，130，90分钟高压灭菌(许多实验室高温灭菌两次)二、提取核糖核酸的注意事项1.组织核糖核酸提取失败的两个主要现象是：核糖核酸降解和组织中杂质的残留。关于降解，首先看看为什么从培养细胞中提取的核糖核酸不容易降解。现有的核糖核酸提取试剂都含有能够快速抑制核糖核酸酶的成分。将裂解液加入培养细胞中，简单混合均匀，使所有细胞和裂解液充分混合均匀，细胞完全裂解。细胞裂解后，裂解物中的活性成分立即抑制细胞中的核糖核酸酶，因此核糖核酸可以保持完整。也就是说，培养的细胞不容易降解它们的核糖核酸，因为它们容易和快速地与裂解物接触。另一方面，组织中的核糖核酸很容易降解，因为组织中的细胞不容易迅速与裂解物充分接触。因此，假设有一种方法可以在将组织转化为单个细胞的同时抑制核糖核酸的活性，降解问题就可以完全解决。液氮研磨是最有效的方法。然而，液氮研磨法是非常麻烦的，当样品的数量相对较大时，它会感觉更麻烦。这就产生了第二个最好的方法：均质机。匀浆法没有考虑在细胞与裂解物接触之前如何抑制Rnase活性，但祈祷组织破坏的速度快于细胞中Rnase降解Rnase的速度。电动均质机的效果比玻璃均质机好，但一般来说，均质机方法不能防止降解。因此，如果在提取过程中发生降解，原来的电动均质机将改为用液氮研磨。最初的玻璃均质机被电动均质机取代或直接用液氮研磨，几乎100%的问题都可以解决。杂质残留影响后续实验的原因比降解更多样，解决方案也相应不同。简而言之，如果组织中存在降解或杂质残留，则必须优化特定实验材料的提取方法/试剂。没有必要使用您宝贵的样本进行优化：您可以从市场上购买一些小动物，如鱼/鸡，提取相应的部分材料进行核糖核酸提取，并使用其他部分进行蛋白质提取-口腔碾磨和胃肠提取。2.核糖核酸提取的目的核糖核酸对不同的后续实验有不同的质量要求。cDNA文库的构建要求RNA的完整性，不含酶反应抑制剂残基。Northern对核糖核酸的完整性要求较高，对酶反应抑制剂残基的要求较低。逆转录聚合酶链反应不需要高的核糖核酸完整性，但需要酶抑制剂的严格残留。投入决定产出；每次，目标都是获得最高纯度的核糖核酸，这就浪费了人力和金钱。3.样品收集/保存-影响降解的因素样品离开活体或原始生长环境后，样品中的内源酶将开始降解核糖核酸，降解速度与内源酶的含量和温度有关。传统上，只有两种方法可以完全抑制内源酶的活性：立即加入裂解液并彻底快速地匀浆；切成小块，立即放入液氮中冷冻。这两种方法都需要快速操作。后者适用于所有样品，而前者仅适用于内源酶含量低且易于均质化的细胞和组织。具体来说，植物组织、肝脏、胸腺、胰腺、脾脏、大脑4.样品的破碎和均质化-影响降解和产率的因素将样品破碎以完全均质化，均质化是为了完全和完全释放核糖核酸。细胞可以直接匀浆而不破碎，组织只有在破碎后才能匀浆，酵母和细菌只有在用相应的酶破壁后才能匀浆。内源酶含量低且易于均质化的组织可在裂解物中用均质器粉碎并均质化一次。植物组织、肝脏、胸腺、胰腺、脾脏、大脑、脂肪、肌肉组织等的样本。或者内源酶含量高或者不容易均质化，因此组织破碎和均质化必须分开处理。最可靠、产量最高的破碎方法是液氮研磨，最可靠的均化方法是电动均质机。应特别注意使用液氮进行研磨：在整个研磨过程中，样品不得熔化，因为内源酶在冷冻后更容易起作用。5.热解溶液的选择影响操作便利性和内源杂质残留的因素常用的裂解物几乎能抑制Rnase活性，因此，裂解物的选择应与纯化方法一起考虑。只有一个例外：建议内源酶含量高的样品使用含酚的裂解物，以提高灭活内源酶的能力。6.纯化方法的选择影响内源杂质残留和提取率的因素对于干净的样品，如细胞，几乎任何现有的纯化方法都可以获得令人满意的结果。然而，对于许多其他样品，尤其是那些杂质含量高的样品，如植物、肝脏、细菌等。选择合适的纯化方法非常重要。柱离心纯化法提取速度快，能有效去除影响后续酶反应的杂质，但价格较高。使用经济、经典的提纯方法，如氯化锂沉淀法，也能获得满意的结果，但操作时间长。7、核糖核酸提取“三大纪律八项注意”学科1:停止外源酶的污染。注1:严格戴口罩和手套。注2:实验涉及的离心管、吸头、移液管杆、电泳槽和实验台面应彻底处理。注3:实验中涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保不含核糖核酸酶。规程2:防止内源酶的活性注4:选择合适的均化方法。注释5:选择合适的裂解溶液。注6:控制样品的起始量。学科3:定义你的提取目的注7:当任何裂解物系统接近样品的最大起始量时，提取成功率急剧下降。注8:成功提取核糖核酸的唯一经济标准是后续实验的成功，而不是产量。8.核糖核酸酶污染的十大来源1)手指，手指是外源酶的第一来源，因此必须经常戴手套和更换。此外，必须戴口罩，因为呼吸也是酶的重要来源。戴手套和口罩的另一个好处是保护实验室人员。2)枪头、离心管、移液管-核糖核酸酶不能通过简单的灭菌而失活，因此枪头和离心管应该用DEPC处理，即使它被标记为DEPC。移液管最好是特殊的。使用前用75%酒精棉球擦拭干净，尤其是杆子。此外，您不得使用头部拆卸工具。3)水/缓冲溶液必须确保没有核糖核酸酶污染。4)至少，实验桌应该用75%酒精棉球擦拭干净。5)内源核糖核酸酶的所有组织都含有内源酶，因此用液氮快速冷冻组织是减少降解的最佳方法。液氮储存/研磨法确实不方便，但它是某些组织内源酶含量高的唯一方法。6)核糖核酸样品的核糖核酸提取产物可能含有微量核糖核酸酶污染。7)质粒提取质粒提取经常使用核糖核酸酶降解核糖核酸，残留的核糖核酸酶被蛋白酶K消化，并通过PCI提取。8)核糖核酸的保存即使在低温下保存，微量的核糖核酸酶也会导致核糖核酸的降解。长期保存核糖核酸的最好方法是盐/酒精悬浮液，因为酒精在低温下会抑制所有酶的活性。9)当阳离子(钙、镁)含有这些离子时，80加热5分钟将导致核糖核酸被剪切。因此，如果核糖核酸需要加热，保存溶液需要10)后续实验中使用的所有酶都可能被核糖核酸酶污染。9.提取核糖核酸的十大秘诀1.快速防止Rnase活性样品在收集后被快速冷冻，并在裂解过程中快速使Rnase失活。2.为核酶含量高的组织选择合适的提取方法，脂肪组织优选含酚。3.Northern是预判断质量所必需的。构建cDNA文库需要高度的完整性。逆转录聚合酶链反应和核糖核酸酶保护试验不需要高完整性。逆转录聚合酶链反应需要高纯度(酶抑制剂残留)。4.彻底均质化是提高产量和减少降解的关键。5.检查核糖核酸电泳的完整性，28S: 18S=2: 1是一个完整的标记，1: 1是大多数实验可以接受的。6:脱氧核糖核酸的去除用于逆转录聚合酶链反应。阵列分析优选使用脱氧核糖核酸酶1去除脱氧核糖核酸。7:减少外源酶的污染酶不能从外部引入。8:当浓缩低浓度核酸时，应添加沉淀辅助试剂。然而，有必要防止共沉淀剂被酶和DNA污染。9:将核糖核酸完全溶解，必要时在65加热5分钟。10:适当的保存方法可以在20下保存一小段时间，在80下保存一段时间。提高核糖核酸产量首先，我们应该认识到不同样品的核糖核酸含量差异很大。高丰度(2-4微克/毫克)如肝、胰腺、心脏，中等丰度(0.05-2微克/毫克)如脑、胚胎、肾、肺、胸腺、卵巢，低丰度(0.05微克/毫克)如膀胱、骨、脂肪。1:裂解细胞释放核糖核酸如果核糖核酸不释放，产量将下降。电均化比其他均化方法更有效，但可能需要与其他方法结合，如液氮糖化和酶消化。2.提取方法的优化。基于苯酚的方法的最大问题是不完全分层和部分核糖核酸损失(上清液不能完全去除)。不完全分层是由于核酸和蛋白质含量高，这可以通过增加裂解物的量或减少样品的量来解决。脂肪组织应该用氯仿提取。去除有机层后，通过反向提取或离心可以减少核糖核酸的损失。基于柱的离心最大的问题是样品过量。10.经典提取技巧1)苯酚的纯化：加入等体积的11)苯酚/氯仿，剧烈混合1-2分钟。高速离心2分钟。小心取上清液(80-90%)。永远不要去中间层。可以将等体积的反应溶液加入苯酚/氯仿中，也可以取出上清液。两种上清液可以混合在一起进行核酸沉淀，以提高产量。混合时不要太温和，也不要试图去除所有的上清液。2)70-80%乙醇洗涤：在洗涤过程中，必须悬浮核酸以确保洗去残留的盐。同时，倒出乙醇后，立即高速离心几秒钟，然后用移液管除去残留的乙醇。室温放置5-10分钟，然后溶解。11.特殊组织的提取1)纤维组织：从心肌/骨骼肌和其他纤维组织中提取核糖核酸的关键是完全压碎组织。这些组织细胞的密度很低，所以单位重量的组织核糖核酸含量很低，最好使用尽可能多的起始量。组织必须在冷冻条件下彻底磨碎。2)蛋白质/脂肪含量高的组织：脑/植物脂肪含量高。经皮冠状动脉介入治疗提取后，上清液中含有白色絮状物。上清液必须用氯仿再次提取。3)核酸/核酶含量高的组织：脾脏/胸腺及其他核酸和核酶含量高的组织。核酶可以通过在冷冻条件下研磨组织然后快速均质化来有效地灭活。然而，如果裂解物太粘(由于核酸含量高)，经皮冠状动脉介入提取不能有效地分层。加入更多的裂解液可以解决这个问题。多次经皮冠状动脉介入提取可以去除更多残留的脱氧核糖核酸。如果加入酒精后立即形成白色沉淀，则表明存在DNA污染。溶解后，可通过用酸性经皮冠状动脉介入术重新提取来去除DNA污染。4)植物组织：植物组织比动物组织更复杂。一般来说，每个人都在液氮中研磨植物，所以内源酶降解核糖核酸是不常见的。如果降解问题无法解决，几乎可以肯定的是，样品中含有杂质。许多植物中含有的杂质会导致残留物，这通常是由于这些杂质和核糖核酸之间的一些相似之处：你沉淀我，沉淀我，你吸附我，吸附我。这些特性决定了它们是非常强的酶抑制剂。目前，商业上的核糖核酸提取试剂经过小的调整后可以适用于几乎所有的动物组织，但是没有商业上的核糖核酸提取试剂可以适用于大多数植物组织。12.冻融对样品的影响冷冻样本可能很大，需要在提取核糖核酸之前进行切割。在切割过程中，样品经常熔化(可能部分熔化)。冷冻样本可能需要在提取核糖核酸之前称重，这个过程肯定会融化。有时，样品会在液氮研磨过程中熔化。或者将冷冻样品直接添加到裂解物中，无需液氮研磨，并且在完全均质化之前一定会发生熔化。实验表明，在融化过程中，冷冻组织比新鲜组织更容易发生核糖核酸降解。可能的原因是冻融过程破坏了细胞结构，使内源酶更容易直接接触核糖核酸。13、核糖核酸质量的判断通常，电泳用于判断核糖核酸的完整性，A260/A280用于判断核糖核酸的纯度。理论上，完整的核糖核酸的比率是28S: 18S=2.7: 1，而大多数数据强调的比率是28S: 18S=2: 1。事实是，从除细胞外的其他样品中提取的核糖核酸很难达到2: 1的比例(这一结论是由安捷伦生物分析仪得出的)。核糖核酸的电泳结果受多种因素影响，包括二级结构、电泳条件、样品量、电子束饱和程度等。用非变性电泳检测核糖核酸，用脱氧核糖核酸标记作为对照。如果2kb处的28S带和0.9kb处的18S带是清晰的，并且28S: 18S1，则完整性可以满足后续实验的大部分要求。A260/A280是一个给每个人都带来很多困惑的指标。首先，这种核酸指示剂的原意很清楚：纯核糖核酸，A260/280=2.0左右。纯核糖核酸是“因”，A260/A280=2是“果”。现在每个人都用A260/A280作为“原因”，认为“如果A260/A280=2，那么核糖核酸是纯的”，混淆自然会出现。如果你感兴趣，加入一些萃取中常用的试剂，如苯酚、异硫氰酸胍、聚乙二醇等。然后测量A260/A280的比值。现实情况是，许多用于提取核糖核酸的试剂和样品中的许