SIALC研究蛋白质相互作用原理.ppt

SILAC研究蛋白质相互作用,辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663,SILAC研究蛋白质相互作用,1：SILAC定量蛋白质组学原理2：SILAC研究蛋白质相互作用原理3：SILAC研究蛋白质相互作用文献,辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663,1：SILAC定量蛋白质组学原理,1.1：SILAC定量蛋白质组学的原理1.2：SILAC技术流程1.2.1：培养基准备1.2.2：细胞标记与测试1.2.3:实验处理1.2.3：蛋白质分离与质谱分析1.2.4：结果形式,辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663,1.1：SILAC定量蛋白质组学原理,辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663,简介：SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术，在细胞培养时，采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养，细胞经传代培养5-6代后，蛋白质将被同位素稳定标记，等量混合标记的蛋白质后分离和质谱鉴定，根据一级质谱图中三个同位素型肽段的面积比较进行相对定量和二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。技术优势：1：高通量，可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质；2：定量精确，降低由于样品制备不同而造成的实验差异；3：线性定量范围广；4：灵敏度更高，蛋白质需要量明显减少；5：标记采用的是体内标记技术，更接近样品真实状态。,SILAC法。1、标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C615N4)、Arg(13C6,或13C615N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”；2、细胞处理，如药物处理；3、细胞裂解、提取蛋白质；4、等量混合对照与处理组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色；5、割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。,1.1：SILAC定量蛋白质组学原理,1.2.1：培养基准备,材料：（1）：Lys或（和）Arg缺陷型1640培养基，Lys或（和）Arg缺陷型DMEM培养基。（2）：透析FBS。（3）：稳定同位素标记的Lys和Arg。L-Lysine(13C6),L-Lysine(13C6,15N2),L-Lysine(13C6,15N2),L-Lysine(15N2,D9),L-Lysine(4,4,5,5-D4),L-Arginine(13C6),L-Arginine(13C6,15N4),L-Arginine(13C6,15N4)。培养基制备：取相应量的稳定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培养基中，同时添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um滤膜过滤，4度保存备用。根据实验的需要，可以配制“中”型和“重”型培养基。,辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663,1.2.2：细胞标记与测试,标记：一般细胞经过添加同位素的培养基传代培养5-6代后，一天或2天传代一次，细胞中蛋白质的Lys和Arg将被同位素氨基酸取代。添加了稳定同位素（“中”或“重”型）的细胞与“轻”型细胞相比细胞生长速度可能偏慢，这是由于透析血清与中缺乏一些盐成分，可以让透析血清在PBS里面透析，透析膜的孔径一般为10KDa.标记测试：在进行正式实验之前，需要对细胞进行标记测试，测试细胞中蛋白质的Lys和（或）Arg是否被相应的同位素氨基酸取代。收取蛋白质后，等量混合，SDS-PAGE分离，LC-MS/MS检测。,辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663,1.2.2：细胞标记与测试,细胞经过传代培养7天后，同一肽段被“重”型肽段取代,辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663,1.2.3:实验处理,辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663,当标记测试检测到蛋白质已被同位素氨基酸标记后，可以进行细胞处理，如药物处理，病毒处理等。,1.2.3：蛋白质分离与质谱分析,（1）：提取“轻”型”，“中”型，“重”型细胞蛋白质，等量混合，SDS-PAGE分离，染色。（2）：割取蛋白质条带，胰蛋白酶酶切。（3）：LC-MS/MS（仪器：LTQOrbitrapXL)分析，数据检索。,辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663,1.2.4：结果形式,LC-MS/MS分析结果，将会给出每个肽段的质谱峰图及定量信息。结果将会已EXCEL表格呈现。肽段质谱峰图及表达量：,2:SILAC研究蛋白质相互作用,2.1：SILAC研究蛋白相互作用原理2.2:SILAC研究蛋白质相互作用特点2.3：SILAC研究蛋白质相互作用方法分类2.3.1：Pull-down法2.3.2:Tag-CoIP法2.3.3：Bait-CoIP法2.3.4：RNAi-Bait-CoIP,辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663,2.1：SILAC研究蛋白质相互作用原理,辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663,简介：SILAC法研究蛋白质间相互作用与传统的pulldown和CoIP法相比，其方法的灵敏度更高、特异性更强.其原理是通过质谱鉴定和分析蛋白质相对量来判断是否是特异性结合，实验组相对于对照组某个蛋白质量的差异达到统计学的差异时，就判定这个蛋白质与目的蛋白质有相互作用。,2.2：SILAC研究蛋白质相互作用特点,技术优势目前寻找蛋白质相互作用最先进的方法，与传统CoIP或Pulldown相比，改技术具有以下特点：（1）特异性强，假阳性率低；（2）高通量，能同时鉴定出成百甚至上千个蛋白质，能最大限度的寻找到与目的蛋白质相互作用的蛋白质；（3）灵敏度高，液相与质谱连用，肽段分离与质谱鉴定连用，灵敏度比普通质谱高。,辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663,2.3SILAC研究蛋白质相互作用方法分类,2.3.1：Pull-down法2.3.2:Tag-CoIP法2.3.3：Bait-CoIP法2.3.4：RNAi-Bait-CoIP2.3.5：上述四种方法比较,辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663,2.3.1Pulldown法,原理：（1）:体外表达（原核表达，真核表达等)，纯化出目的蛋白质(tag-bait)及目的蛋白质的对照蛋白（如tag,tag-controlprotein等).（2）:用tag-bait与标记上“重”型细胞的蛋白质pulldown,同时用tag-control与“轻”型细胞蛋白质pulldown。（3）:等量混合两次pulldown的蛋白质进行LC-MS/MS分析.（4）：交差pulldown,用tag-bait与“轻”型细胞蛋白质pulldown,tag-control与“重”型细胞蛋白质pulldown.,Methods.2011Aug;54(4):387-95.Epub2011Mar5,2.3.2Tag-CoIP法,原理：（1）：用“重”稳定同位素氨基酸标记细胞后，转染代有标签的目的蛋白质（如GFP-bait,已可用其他标签，如flag,his,biotin等)质粒进入“重”型细胞。（2）：提取“重”型和“轻”型细胞的蛋白质（总蛋白质，核蛋白，膜蛋白质等），等量混合“重”型蛋白和“轻”型蛋白质。（3）：用tag标签的抗体进行CoIP,沉淀下来的蛋白质SDS-PAGE分离后，LC-MS/MS分析。,2.3.3常规CoIP法,原理：（1）：“重”型稳定同位素氨基酸标记细胞后，分别提取“轻”型细胞和“重”型细胞的蛋白质。（2）：“重“型细胞蛋白质用目的蛋白质抗体进行CoIP，”轻“型细胞蛋白质用对照抗体进行CoIP。（3）：等量混合步骤2重CoIP下来的蛋白质或者等量混合CoIP后的Beads,SDS-PAGE分离后，LC-MS/MS分析。,原理：（1）将细胞用“重”型同位素氨基酸标记，“轻”型细胞用目的目的蛋白